離子交換固相萃取-反相高效液相色譜法測定黃酒中游離嘌呤

劉鎮,張瑛,鄭云峰,胡翎榆,屠生輝,吳堅

1(紹興市食品藥品檢驗研究院,國家黃酒產品質量監督檢驗中心,浙江 紹興,312000) 2(紹興市標準化研究院,浙江 紹興,312000)

尿酸是嘌呤代謝的終產物,當人體攝入過多或者嘌呤代謝紊亂,則體內尿酸滯留過多,容易導致高尿酸血癥[1-3]。根據近年各地高尿酸血癥患病率的報道,目前我國約有高尿酸血癥者1.2億,且患病率呈逐年上升趨勢[4-5]。現代研究表明,高尿酸血癥不僅是痛風的重要生化基礎,還是某些疾病并發癥的獨立危險因子,與高血壓、肥胖、高脂血癥、內分泌代謝紊亂以及動脈粥樣硬化均有密切關聯[6]。

我國現代飲食習慣中嘌呤含量較高的食品逐漸占主體地位,而飲食習慣對痛風和高尿酸血癥的發生有重要影響[7-8]。飲酒會提高血清尿酸水平,酒精攝入過量會增加痛風的發病風險[9-10]。酒類的嘌呤主要以游離堿基形式存在,比普通食品中的嘌呤更容易被吸收,同時由于酒精代謝產物對尿酸排泄有抑制作用,可以在短時間內迅速提高血尿酸水平。目前,對酒類食品中嘌呤測定的研究主要集中在啤酒上[11]。黃酒是我國的一種傳統發酵酒,營養豐富,享有“液體蛋糕”的美名且具有一定的藥用價值,深受消費者的喜愛,但關于黃酒中嘌呤含量的文獻報道較少。

現有關于食品中嘌呤檢測的報道中少有提及樣品的凈化步驟,一般將樣液或樣品水解液過濾膜后進樣[12-14]。針對少部分黃酒如清爽型黃酒,直接進樣法可以滿足分析要求[15-16],但是對于大部分黃酒,由于糖類、蛋白質、氨基酸、多肽、色素、生物胺等化合物的影響,存在加標回收率低、色譜峰重疊、檢出限高等問題。固相萃取技術是食品檢測中常用的樣品前處理技術,可利用固體吸附劑、淋洗液以及洗脫液對樣品中目標化合物及干擾雜質的不同吸附、洗脫能力,達到分離和富集目標化合物的目的。本研究根據嘌呤化合物的酸堿性,建立了一種同時測定黃酒中腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤的離子交換固相萃取-高效液相色譜法。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

腺嘌呤(純度≥99.5%)、鳥嘌呤(純度≥99%)、黃嘌呤(純度≥98%)、次黃嘌呤(純度≥99%)，阿拉丁； 磷酸(質量分數85%，AR)、KH2PO4(AR)、KOH(AR)、鹽酸(AR)、氨水(質量分數25%～28%，AR)，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇(色譜純)，Merck KGaA；MCX混合陽離子交換固相萃取小柱(500 mg，6 mL)、SCX強陽離子交換固相萃取小柱(500 mg，6 mL)、WCX弱陽離子交換固相萃取小柱(500 mg，6 mL)，上海安譜實驗科技股份有限公司。

黃酒樣品全部為市售商品,產品類型包括甜型、干型、半干型、半甜型。

1.2 儀器與設備

LC-20ADXR高效液相色譜儀,日本島津公司；ME204E精密電子天平、S220酸度計,梅特勒-托利多公司；N-EVAP-24氮吹儀,美國Organomation公司。

1.3 分析方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3(4.6 mm×150 mm,3 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液(pH=4.06±0.02)；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；檢測器：紫外檢測器(UV)；檢測波長：254 nm。

1.3.2 標樣配制

準確稱取腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤標樣25 mg,分別用超純水定容至25 mL,配制成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備溶液(嘌呤不易溶于水,可加入NaOH溶液助溶)。標準儲備溶液儲存于2～4 ℃冰箱中,使用前用超純水稀釋到一定質量濃度。

1.3.3 黃酒樣品除乙醇

取25 mL黃酒樣品,煮沸至酒樣體積約為20 mL,冷卻至室溫后,用蒸餾水將酒樣定容至25 mL。

1.3.4 樣品的凈化

MCX混合陽離子交換小柱預先用5 mL甲醇、5 mL 0.1 mol/L鹽酸活化。取2 mL預先除去乙醇樣品,加1 mL 0.1 mol/L鹽酸酸化后上樣,以5 mL 0.1 mol/L鹽酸淋洗小柱,抽干,以10 mL氨水-甲醇(體積比1∶3)洗脫。分別收集淋洗液和洗脫液,氮吹至近干,殘留物以10 mL超純水定容。過0.45 μm微孔濾膜后進液相色譜儀分析。

2 結果與討論

2.1 色譜分析條件的確認

本研究參考文獻[17]的方法并做適當調整,采用Waters AtlantisT3柱進行分離,結果如圖1所示。

1-鳥嘌呤；2-次黃嘌呤；3-黃嘌呤；4-腺嘌呤圖1 不同pH下4種嘌呤標準品液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of four purine standards with mobile phase of different pH

腺嘌呤、鳥嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤這4種組分可實現完全分離,且峰形好,無拖尾。流動相pH對4種嘌呤分離影響顯著,對流動相pH進行優化,發現以0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液(pH=4.06±0.02)為流動相,4種嘌呤組分可實現完全分離。

2.2 離子交換固相萃取法凈化酒樣

2.2.1 固相萃取小柱的選擇

嘌呤在酸性條件下為陽離子,可以采用離子交換固相萃取技術對其進行分離、富集。MCX混合型陽離子交換柱是將磺酸基鍵合在高度交聯的苯乙烯/二乙烯基苯(PS/DVB)表面得到的混合型強陽離子交換吸附劑[18],具有反相和陽離子交換雙重保留性能,對堿性化合物有良好的保留能力。SCX強陽離子交換柱是硅膠基質的苯磺酸基填料,其負電性的磺酸基具有很強的陽離子交換能力,此外苯環有一定的疏水作用,能萃取堿性化合物。WCX弱陽離子交換固相萃取小柱是以大孔PS/DVB為基質,經羧基修飾的混合型弱陽離子吸附劑,也適合堿性化合物的提取[19]。加標回收試驗表明(見附件),MCX小柱凈化效果優于SCX小柱和WCX小柱。SCX小柱對鳥嘌呤、次黃嘌呤和腺嘌呤的吸附作用強,但是對黃嘌呤的保留能力弱,在淋洗液中檢出黃嘌呤。MCX小柱對4種嘌呤的均有強保留,在淋洗液中無嘌呤檢出,在洗脫液中檢出4種嘌呤,且濃度與未凈化樣品差別不大。因此選擇MCX混合型陽離子交換柱。

2.2.2 活化液及洗脫液的選擇

離子交換固相萃取包含4個過程。(1)吸附劑的活化：使用1個柱體積的甲醇潤濕吸附劑,使用合適pH的緩沖溶劑置換甲醇并調整小柱的pH；(2)上樣：調節樣品pH后上樣；(3)淋洗除去干擾物：用合適pH的緩沖液淋洗柱管,去除基質干擾物,同時要維持目標分析物的保留；(4)洗脫：使用一定濃度的氨水-甲醇緩沖液洗脫,收集目標分析物。整個過程中,pH的控制尤為重要,其可以改變目標物/吸附劑的離子化或質子化程度。目標物必須完全離子化才可以保證其被吸附劑完全吸附保留,需要滿足2個條件：(1)環境的pH必須使分析物和吸附劑帶相反電荷；(2)環境不能含有高濃度帶有和分析物相同電荷的競爭化合物。有機化合物的pKa值是決定環境pH值的重要依據。

上樣時,為使該化合物99%離子化,樣品基質的pH應低于該化合物pKa至少2個pH單位[20]。洗脫時,要使99%該化合物脫附,體系環境的pH值必須高于該化合物pKa至少2個pH單位。鳥嘌呤pKa=9.92,次黃嘌呤pKa=8.7,黃嘌呤pKa=9.95,腺嘌呤pKa=4.12,因此在上樣前,用0.1 mol/L鹽酸調節樣品pH至2以下,以保證所有嘌呤化合物完全離子化。用5 mL 0.1 mol/L鹽酸活化小柱,用5 mL 0.1 mol/L鹽酸作為淋洗液,以保持環境pH,在除去雜質的同時維持所有嘌呤化合物在陽離子交換柱上的保留。離子交換固相萃取小柱中鍵合吸附劑與分析物之間的非極性部分之間的次級相互作用,會造成洗脫不徹底的現象,需要向洗脫液中加入有機溶劑甲醇,以提高分析物的回收率,因此使用氨水-甲醇(體積比1∶3,pH=12)作為洗脫液。采用HPLC法分析樣品原液、鹽酸淋洗液、目標物洗脫液,其液相色譜圖如圖2所示,目標化合物峰面積未減少,說明4種嘌呤均有較高回收率；離子交換固相萃取凈化法可將黃酒樣品中與腺嘌呤出峰時間相近(11 min左右)、光譜譜圖相似的假陽性物質全部除去,提高了分析準確度與實驗效率。

a-未凈化樣液；b-氨水甲醇洗脫液(凈化后樣液)；c-鹽酸淋洗液;1-假陽性物質；2-腺嘌呤圖2 MCX小柱凈化黃酒樣品的洗脫液和淋洗液高效液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of compounds in Huangjiu sample determined by HPLC-UV

2.3 方法性能

在優化條件下,將標準儲備溶液逐級稀釋,得質量濃度為0.1～25 mg/L混合標準工作溶液,對其進行測定,以保留時間結合紫外全光譜對目標化合物定性,以峰面積外標法定量。由表1可知,在0.1～25 mg/L質量濃度范圍內,4種嘌呤的峰面積與質量濃度呈良好的線性關系,相關系數R>0.999 9。通過在1天內對同一樣品測定6次和連續6 d對同一樣品進行測定,4種嘌呤的日內和日間精密度均小于4%,說明該方法具有較高的重復性。

表1 四種嘌呤的線性方程、相關系數、日內及日間精密度Table 1 Regression equation,correlation coefficients,LODs,intra-day and inter-day variations

準確度通過向半干型黃酒樣品中添加3個質量濃度水平的嘌呤混標,計算回收率來確定,每個質量濃度做6次平行試驗。由表2可知,4種嘌呤的回收率在83.13%～98.32%,精密度為1.63%～9.62%。以信噪比3∶1 確定檢出限。

表2 半干型黃酒中4種嘌呤檢出限及不同質量濃度下加標回收率(回收率±RSD)Table 2 LODs and recovery rates of the purines added to semi-dry Huangjiu samples spiked with three different concentrations of the standard solution(means±RSD)

對甜型、半甜型、干型黃酒也做了加標回收試驗,加標質量濃度與樣品本底濃度相等,每個樣品做6次平行試驗,其回收率與精密度見表3。4種嘌呤的回收率在87.5%～112.5%,精密度在0.39%～9.12%,符合日常分析要求。

表3 不同類型黃酒中4種嘌呤加標回收率(回收率±RSD)Table 3 Recovery rates of the purines added to different types of Huangjiu samples(means±RSD)

2.4 實際樣品的測定

為了驗證本方法的有效性,對市售15份黃酒樣品中的鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤進行了測定,結果見圖3。3種類型黃酒中均能檢測到4種游離嘌呤,總含量在50～90 mg/L,其中次黃嘌呤和黃嘌呤的含量高于鳥嘌呤和腺嘌呤。

圖3 黃酒樣品中嘌呤質量濃度Fig.3 Purine contents of Huangjiu samples

3 結論

建立了同時測定黃酒中游離鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤的高效液相色譜-紫外分光光度法。對色譜條件進行優化,以0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖液為緩沖液,pH值為(4.06±0.02)時,其分離效果最好。使用MCX混合陽離子交換固相萃取小柱進行樣品凈化,減少了雜質干擾,提高了方法的選擇性與靈敏度。4種嘌呤的回收率在83.13%～98.32%之間,日內和日間的精密度、檢測限和線性均能滿足日常分析要求。結果表明,該方法簡便、快速、靈敏度高、重復性好,可用于黃酒中游離嘌呤的分析檢測。