熒光探針在高通量篩選技術(shù)上的應(yīng)用進(jìn)展

劉宜嵩,王壬,2,鈕成拓,2,鄭飛云,2,王金晶,2,李崎,2,劉春鳳,2*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214222) 2(江南大學(xué),釀酒科學(xué)與工程研究室,江蘇 無錫,214222)

熒光探針可針對特定的目標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)生熒光信號,并達(dá)到分析檢測的目的。作為一種重要檢測手段,熒光探針的應(yīng)用范圍已擴(kuò)展至化學(xué)、環(huán)境以及生命科學(xué)等,并隨著學(xué)科間的交叉不斷拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域。本文主要針對熒光探針在高通量篩選技術(shù)上的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)的綜述,分析了這一技術(shù)的特點以及存在的問題,為這類快速且高效的篩選技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考依據(jù),對高通量篩選技術(shù)的發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。

1 熒光探針簡介

18世紀(jì)中期,STOKES首次提出“熒光”的概念,對第一個定義明確的小分子熒光團(tuán)奎寧的發(fā)光過程進(jìn)行了解釋。1856年,PERKIN成功合成了熒光染料類化合物苯胺紫,拉開了人工合成熒光染料的序幕[1]。1962年,SHIMOMURE等[2]從多管水母屬中分離得到了綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP),GFP作為最早被開發(fā)的一類熒光探針在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[2]。在隨后的發(fā)展過程中,熒光探針從GFP向有機(jī)小分子熒光探針擴(kuò)展,第1個有機(jī)小分子熒光探針可追溯至20世紀(jì)80年代,學(xué)者們對熒光探針給出的準(zhǔn)確的定義為：熒光探針是一種分子器件,能夠選擇性的與客體分子通過化學(xué)或者物理之間的相互作用,產(chǎn)生熒光信號,進(jìn)而實現(xiàn)定量與定性檢測客體分子的目的。隨著熒光探針檢測技術(shù)的不斷發(fā)展,針對不同種物質(zhì)具有功能特異性的熒光探針不斷涌現(xiàn),在近50年的發(fā)展過程中,熒光探針已被應(yīng)用于生物細(xì)胞成像、環(huán)境分析、食品科學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。近年來各類新型熒光探針的出現(xiàn)不斷拓寬這一技術(shù)的適用范圍,可檢測的物質(zhì)越來越廣泛,如金屬離子[3]、CO[4-6]、H2S[7]和甲醛[8]等。然而,各領(lǐng)域始終存在對可利用的新型熒光探針的需求,因此,設(shè)計并合成新型高效的熒光探針勢在必行。

1.1 熒光探針的組成

熒光探針一般由3個部分構(gòu)成：熒光基團(tuán)、識別基團(tuán)和連接基團(tuán),也有一些非典型結(jié)構(gòu)的熒光探針無連接基團(tuán)部分。

熒光基團(tuán)可以釋放出熒光信號,實現(xiàn)對目標(biāo)物質(zhì)的檢測。熒光基團(tuán)的性質(zhì)決定了探針的靈敏度與準(zhǔn)確性,常用的熒光基團(tuán)包括：香豆素類、奈酰亞胺類、羅丹明類、熒光素類、苯并雙噻二唑類和氟硼二吡咯類等[9](圖1)。

圖1 常見熒光團(tuán)結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of common fluorophores

識別基團(tuán)對待測物質(zhì)具有特異性識別功能,識別效果決定了探針的選擇性和特異性。一般情況下,識別基團(tuán)與待測物可通過弱作用力或化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行結(jié)合,作用力包括范德華力、氫鍵、親疏水作用等,化學(xué)反應(yīng)可以是加成反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)等[5]。

熒光探針與目標(biāo)物相結(jié)合后將識別信息經(jīng)連接基團(tuán)傳遞給熒光基團(tuán),不同種熒光探針連接基團(tuán)形式多樣,最常見方式是利用共價鍵的形式將熒光基團(tuán)與識別基團(tuán)連接起來。

1.2 熒光探針的作用機(jī)理

熒光探針的作用機(jī)理如圖2所示。隨著研究的不斷深入,有關(guān)熒光探針作用機(jī)理的研究已經(jīng)有了很大進(jìn)展,主要包括以下幾種：

圖2 熒光探針機(jī)理示意圖Fig.2 Schematic diagram of fluorescent probe mechanism

(1)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(intramolecular charge transfer,ICT)[10]。ICT通過改變電子吸收能力、電子給體或是Π-共軛程度來與目標(biāo)物相互作用,導(dǎo)致吸收光譜變化,實現(xiàn)發(fā)射峰紅移或是藍(lán)移,這是目前熒光探針最常依據(jù)的原理。依據(jù)ICT設(shè)計的熒光探針也適用于黏度大的檢測環(huán)境。

(2)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(photoinduced electron transfer,PET)[11]。電子給體與受體之間通過橋梁連接,探針受光激發(fā)后,激發(fā)態(tài)的電子給體與電子受體之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致熒光猝滅發(fā)生；當(dāng)識別基團(tuán)與待測物結(jié)合后,會減弱識別位點供電子能力,阻斷PET效應(yīng),使熒光信號得以恢復(fù)。這一機(jī)理用于設(shè)計開關(guān)型熒光探針。

(3)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)[12]。FRET包括一對熒光團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)移,分別為能量供體和受體,當(dāng)能量的吸收與發(fā)射有一部分重疊且距離≤10 nm時,就會發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。FRET常用于設(shè)計比率型熒光探針。

(4)聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aggregation-induced emission,AIE)[13]。傳統(tǒng)的熒光染料在高濃度時會導(dǎo)致發(fā)光猝滅,而AIE分子在聚集狀態(tài)時,由于分子的空間位阻作用,非輻射躍遷被阻斷,進(jìn)而引發(fā)聚集誘導(dǎo)發(fā)光。依據(jù)AIE設(shè)計的熒光探針可以解決熒光團(tuán)濃度過高而導(dǎo)致聚集猝滅的情況。

(5)激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(excited-state intramolecular proton transfer,EIPT)[14]。依據(jù)這一機(jī)理的熒光探針受到光、熱或電激發(fā)后,分子內(nèi)質(zhì)子受體和給體間發(fā)生質(zhì)子的轉(zhuǎn)移。這一類型的熒光探針由于斯托克斯位移較大,可避免在激發(fā)過程產(chǎn)生自重吸收和內(nèi)部過濾,但對環(huán)境十分敏感,需要提供疏水的膠束環(huán)境,如大量的有機(jī)溶劑。

1.3 熒光探針的分類

目前沒有統(tǒng)一的方法將熒光探針進(jìn)行分類,熒光探針的分類有多種形式,如按照材料、發(fā)射峰特性、發(fā)射波長以及反應(yīng)類型等進(jìn)行分類。雖然目前分類較多,但這些分類方法相互交叉,對熒光探針的設(shè)計與制備有一定指導(dǎo)意義。

根據(jù)材料的不同可以分為：綠色熒光蛋白、納米材料以及有機(jī)小分子熒光探針。有機(jī)小分子熒光探針是近年來應(yīng)用最為廣泛的熒光探針,因其原理清晰、制備較易且成像效果好等優(yōu)點備受青睞。

另一種常見的分類方式是將熒光探針分為比率型和強(qiáng)度型。強(qiáng)度型熒光探針在檢測過程中有單個發(fā)射峰且有猝滅型和增強(qiáng)型2種類型[9]。比率型熒光探針利用2個發(fā)射峰的比值變化定量檢測目標(biāo)物,由于具有自校特點常應(yīng)用于擾動較大的環(huán)境。

其他分類方式：根據(jù)發(fā)射波長的不同分為可見光熒光探針和近紅外(near infrared,NIR)熒光探針；根據(jù)和目標(biāo)物反應(yīng)類型的不同分為反應(yīng)型和配位型；根據(jù)熒光探針吸收光子數(shù)目不同分為單光子熒光探針、雙光子熒光探針和多光子熒光探針；根據(jù)用途的不同分為pH熒光探針、金屬離子熒光探針和核酸熒光探針等；根據(jù)檢測樣品種類不同分為生物類和非生物類熒光探針。

2 熒光探針在高通量篩選技術(shù)上的應(yīng)用

高通量篩選技術(shù)(high-throughput screening,HTS)自20世紀(jì)90年代初次問世以來得到迅猛發(fā)展。針對大量待測物的檢測和篩選,更高的篩選通量、更高的篩選效率以及小型化的檢測方法節(jié)約了許多時間和成本,極大地提高了科研效率。熒光探針以能夠與靶向目標(biāo)物結(jié)合并發(fā)生熒光性質(zhì)的改變?yōu)楹诵?在高通量篩選技術(shù)上的應(yīng)用越發(fā)誘人,并隨著熒光探針技術(shù)的發(fā)展在各領(lǐng)域有著一定的應(yīng)用潛力。

2.1 高通量篩選目的菌株

快速高效的高通量篩選系統(tǒng)可以一次性獲得大量信息,菌株的選育離不開高通量篩選技術(shù)。例如,熒光探針在高通量篩選含脂質(zhì)酵母方面應(yīng)用比較廣泛。SITEPU等[15]為篩選含脂質(zhì)的酵母樣品,對已有的尼羅紅熒光探針檢測方法進(jìn)行了改進(jìn),改進(jìn)重點圍繞提高細(xì)胞膜通透性等方面,實驗結(jié)果表明尼羅紅檢測胞內(nèi)脂質(zhì)的效率得到了提升,適當(dāng)降低尼羅紅的濃度也不會影響檢測結(jié)果,整套高通量篩選方法具有高效且低成本的特點。ROSTRON等[16]也將尼羅紅熒光分析法應(yīng)用于生物技術(shù)工業(yè)中快速篩選轉(zhuǎn)基因菌株,在研究中驗證了其在低脂非油脂裂殖酵母野生型和缺失型菌株中脂質(zhì)含量檢測方面的應(yīng)用效果。近期也有研究將改進(jìn)的高通量尼羅紅熒光測定法用于快速篩選含脂質(zhì)酵母,將固體培養(yǎng)和熒光檢測相結(jié)合,使得整個篩選過程更簡便、更高效[17]。除使用尼羅紅作為熒光探針外,CHOI等[18]開發(fā)了親脂性熒光染料,用于對細(xì)胞內(nèi)的聚3-羥基丁酸酯進(jìn)行定量分析,可以染色活菌落,從而可以有效選擇聚3-羥基丁酸酯陽性細(xì)胞,且熒光強(qiáng)度保持時間比尼羅紅更長,間接提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

尼羅紅熒光探針是典型的親脂性熒光探針,在胞內(nèi)脂質(zhì)檢測及含脂質(zhì)酵母篩選的過程中經(jīng)歷了熒光分析方法的優(yōu)化、溶劑的選擇、細(xì)胞預(yù)處理方式以及探針引入方式的探究等諸多階段。這也為其他熒光探針在高通量篩選方案優(yōu)化方面提供了一定的參考,如當(dāng)研究對象為胞內(nèi)物質(zhì)時,可能遇到諸如探針的特異性、其他物質(zhì)的干擾以及熒光強(qiáng)度較弱等問題,此時可參照上述研究中的策略進(jìn)行方法的調(diào)整和優(yōu)化。值得注意的是,選擇尼羅紅這一經(jīng)典熒光團(tuán)設(shè)計脂質(zhì)熒光探針,具有優(yōu)良性能的熒光團(tuán)若加以適當(dāng)?shù)难苌幚?可以提高與目標(biāo)物質(zhì)的特異性結(jié)合效率并展示出良好的熒光效果,將為熒光探針的選擇提供一條便捷的路徑。

除了對產(chǎn)脂質(zhì)酵母進(jìn)行篩選的應(yīng)用外,也有研究對高產(chǎn)聚蘋果酸酵母進(jìn)行高通量篩選,合成了以羅丹明為熒光團(tuán)的熒光探針,該熒光探針的熒光信號與聚蘋果酸含量之間具有良好的定量關(guān)系,可用于評價發(fā)酵液中聚蘋果酸的含量[19]。

熒光探針以其較高的靈敏度、反應(yīng)迅速以及便捷的操作在高通量篩選目的菌株上扮演重要角色,但國內(nèi)外的研究多集中在產(chǎn)脂質(zhì)酵母的篩選,不僅很少涉及其他性狀的酵母,而且也沒有其他微生物的應(yīng)用實例。據(jù)熒光探針設(shè)計方面的報道來看,各種類型的熒光探針,尤其是針對某種化合物的小分子熒光探針已經(jīng)有了比較成熟的制備理論和有效性驗證,如硫醇、H2S、CO以及甲醛等[4-5,7,20]。因此可適當(dāng)拓展高通量篩選目的菌株的實際應(yīng)用范圍。

2.2 高通量篩選抗生素

pH熒光探針是熒光探針技術(shù)的重要應(yīng)用之一,利用pH熒光探針可以對抗生素藥物進(jìn)行高通量篩選。基于pH熒光探針篩選抗生素的研究思路為：細(xì)菌的生長會使菌液酸化,pH熒光探針的熒光信號會隨著菌液的酸化而減弱,抗生素的加入則會使熒光信號減弱的程度降低。有學(xué)者依據(jù)該實驗思路成功地制備了pH熒光探針,并在高通量篩選抗生素上進(jìn)行了應(yīng)用,PAN等[21]的研究主要集中在探針的水溶性上，SI等[22]開發(fā)的熒光探針具有價格低廉、易于合成、高穩(wěn)定性、無毒且易于與基質(zhì)相結(jié)合的特點，設(shè)計的熒光探針適用于實時監(jiān)測細(xì)胞酸化以及抗生素高通量篩選。

以上兩者的研究更注重探針的實際應(yīng)用,也有研究注重于探針設(shè)計,并展示出探針在高通量篩選抗生素上的應(yīng)用潛力。葉文等[23]制備了可以實時監(jiān)測pH的聚合物pH熒光探針并組合在微型反應(yīng)器上,在高通量篩選抗生素方面具有應(yīng)用價值。OTA等[24]開發(fā)了一種基于FRET的核酸探針,該探針被源自液滴中細(xì)菌的核糖核酸酶裂解,導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增加,實驗結(jié)果表明該檢測方法具有高通量篩選抗生素的潛力[24]。

細(xì)菌菌液濃度通常用OD值表示,而熒光探針技術(shù)則具有較高的靈敏度,可在細(xì)菌生長至平衡期時更好地體現(xiàn)細(xì)胞代謝的變化,熒光探針展示出其在高通量篩選過程中的“高質(zhì)量”。熒光探針在高通量篩選抗生素應(yīng)用的同時揭示了通過pH變化來篩選目標(biāo)物的巨大潛力,例如將細(xì)菌的新陳代謝活動作為它們對抗菌藥物敏感性的指標(biāo),可篩選新的生長抑制劑。

2.3 高通量篩選酶抑制劑

熒光探針在高通量篩選酶抑制劑方面有著廣泛的應(yīng)用。其原理與篩選抗生素類似,都是通過監(jiān)測外源物質(zhì)的引入對熒光信號的影響來實現(xiàn)篩選的目的。首先設(shè)計并制備一種與目標(biāo)酶進(jìn)行特異性結(jié)合的熒光探針,篩選過程中對熒光有抑制或增強(qiáng)作用的化合物則為酶抑制劑,也可以使用適當(dāng)?shù)暮瘮?shù)對抑制率進(jìn)行表達(dá)。

LI等[25]開發(fā)了一種熒光探針來檢測內(nèi)源性細(xì)菌青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶(penicillin G acylases,PGA),使用基于新型熒光探針的高通量篩選技術(shù),發(fā)現(xiàn)齊墩果酸是潛在的PGA天然抑制劑,精確測定各種細(xì)菌的內(nèi)源PGA活性也為高通量篩選產(chǎn)PGA菌株提供依據(jù)。XU等[26]合成了2種谷氨酰胺酶(glutaminase,GLS)熒光探針,對構(gòu)建的含有三唑基的化合物文庫進(jìn)行交叉篩選,結(jié)果表明引入三唑基團(tuán)可以抑制GLS活性。此外,也有研究報道了利用熒光探針高通量篩選15-脂氧合酶、單酰基甘油脂肪酶、N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶2以及胱硫醚β-合酶抑制劑的應(yīng)用[27-29]。總之,抑制劑和熒光探針之間競爭酶的作用位點,將熒光信號的變化作為篩選的依據(jù),與通過測定酶活力來篩選抑制劑相比優(yōu)勢明顯。值得注意的是,制備的熒光探針可以針對特定的一種酶或多種酶,其他類型的熒光探針也是如此,設(shè)計出針對某一種特定物質(zhì)的熒光探針實際上是有難度的,需要考慮熒光基團(tuán)與待測物的專一性,根據(jù)研究目的也可以設(shè)計某一類帶有相同的基團(tuán)的熒光探針。

有部分研究側(cè)重目標(biāo)酶熒光探針的設(shè)計,涉及的酶包括金屬蛋白酶-整聯(lián)蛋白15、囊泡單胺轉(zhuǎn)運體2以及膜蛋白,研究重點闡述了熒光探針的合成原理、合成路線以及功能表征,展示出在高通量篩選酶抑制劑上的應(yīng)用前景[30-32]。制備理論的形成是突破性的一步,但還需要實際應(yīng)用來考察技術(shù)的實用性。

2.4 其他高通量篩選技術(shù)上的應(yīng)用

除高通量篩選目的菌株、酶抑制劑和抗生素外,熒光探針技術(shù)在其他高通量篩選技術(shù)方面也有一定應(yīng)用。ZHANG等[33]報道了一種新的膽固醇熒光探針,當(dāng)以高通量形式使用熒光探針時,可在短時間內(nèi)檢測對膽固醇有影響的化學(xué)物質(zhì),這種膽固醇熒光探針提供了一種安全、靈敏且可重現(xiàn)的策略。ZHENG等[34]開發(fā)了熒光高通量篩選方法測定脂肪酶的酯交換活性,用酶標(biāo)儀在96孔微孔板中可檢測熒光物質(zhì)濃度,日篩選樣品量可達(dá)9 200個。兩者的研究都是在已具備一定高通量篩選技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的方法優(yōu)化,熒光探針則為優(yōu)化方案中的關(guān)鍵。在驗證過程中發(fā)現(xiàn),熒光探針篩選方法不僅與傳統(tǒng)篩選方法結(jié)果趨于一致,更重要的是檢測過程簡單、靈敏度高、試劑廉價且對儀器要求低。

此外,高通量自動流動方法測定透析濃縮液中的痕量鋁、高通量篩選環(huán)境樣品中的甲狀腺激素破壞性化合物以及高通量篩選動物毒液等,都展示出熒光探針在高通量篩選技術(shù)上良好的應(yīng)用效果[35-37]。國內(nèi)的研究則主要集中在醫(yī)藥方面的應(yīng)用。蘭小紅等[38]使用3種熒光探針建立了腎保護(hù)活性物質(zhì)的篩選方法,運用高通量方法先對化學(xué)組分進(jìn)行篩選,再結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用得到具體的目標(biāo)物質(zhì),所建立的方法穩(wěn)定且可靠。吳雪莉等[39]對中成藥消渴安中二肽基肽酶-4抑制劑進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)丹酚酸C等對二肽基肽酶-4具有抑制作用,為了得到具體的物質(zhì),同樣需要結(jié)合液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方式,為篩選藥物中藥效物質(zhì)提供了實例,同時也是熒光探針在高通量篩選酶抑制劑方面的應(yīng)用。

3 結(jié)論與展望

熒光檢測技術(shù)是高通量篩選重要的方法之一,發(fā)展高通量篩選技術(shù)符合現(xiàn)代對科研效率的要求,熒光探針依靠與目標(biāo)物特異性結(jié)合實現(xiàn)熒光信號的轉(zhuǎn)變,極大地提高了篩選效率。目前已有多種熒光探針的設(shè)計方案被報道,尤其是有機(jī)小分子熒光探針具有廣闊的應(yīng)用前景。通過對近年來將熒光探針技術(shù)應(yīng)用于高通量篩選的研究進(jìn)行整理,可以投入實際應(yīng)用的熒光探針主要包括以下特點：(1)無需繁瑣的合成路線,有機(jī)小分子熒光探針在這一點上有一定優(yōu)勢；(2)熒光探針作用于目標(biāo)物時具備良好的相容性,熒光信號作為篩選依據(jù)靈敏度高且有效；(3)特異性強(qiáng),尤其對于檢測環(huán)境復(fù)雜或是體系中存在與目標(biāo)物官能團(tuán)相同的物質(zhì),低選擇性會使高通量篩選效率降低。

隨著熒光探針技術(shù)的不斷發(fā)展,學(xué)者們將熒光探針技術(shù)投入到高通量篩選的實際應(yīng)用上來,但在應(yīng)用過程中還存在一定的問題：(1)其他物質(zhì)會對反應(yīng)型熒光探針的作用效果造成干擾,提高選擇性,實現(xiàn)熒光探針與目標(biāo)物的特異性結(jié)合仍是亟待解決的問題；(2)熒光探針的設(shè)計與制備需要進(jìn)行大量的理論研究和驗證實驗,且常涉及到學(xué)科交叉,為了獲得合適的熒光探針一般需要對多種熒光探針進(jìn)行試驗,方法應(yīng)用高效但前期準(zhǔn)備工作量大；(3)除具備實驗條件可自行制備熒光探針的研究外,目前一些將熒光探針應(yīng)用至高通量篩選技術(shù)上的研究需要從已成功制備的熒光探針中進(jìn)行篩選,識別基團(tuán)作為主要的選擇依據(jù)常會伴隨著特異性、靈敏度以及可視化等問題,一定程度上制約了技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)程。

在食品發(fā)酵領(lǐng)域,利用熒光探針可對微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)等進(jìn)行檢測,判斷熒光信號的強(qiáng)弱可實現(xiàn)對目的菌株的高通量篩選,在篩選優(yōu)良菌株方面具有應(yīng)用潛力。在食品檢測分析領(lǐng)域,熒光探針可作為一種環(huán)境友好型檢測方法,避免使用大量的有機(jī)溶劑,減少對人體和環(huán)境的潛在不利影響,綠色檢測方法的應(yīng)用可在真正意義上做到從源頭杜絕食品污染。熒光探針檢測方法步驟簡便且檢測效率高,具有快速性、準(zhǔn)確性及科學(xué)性等突出特點,滿足當(dāng)下食品安全檢測需求,為食品中有毒有害物質(zhì)的檢測提供了有效方法。此外,熒光探針是一種功能性較強(qiáng)的檢測分析工具,快速檢測試劑盒的研發(fā)則可以提高實際應(yīng)用的效率,實現(xiàn)在食品加工、保藏、貯運以及市場監(jiān)控等方面的高效快速檢測。本文為熒光探針應(yīng)用至高通量篩選領(lǐng)域提供了一定線索,特別是對探針選擇以及篩選思路的構(gòu)建進(jìn)行了分析和闡述。