熒光探針在高通量篩選技術上的應用進展

劉宜嵩,王壬,2,鈕成拓,2,鄭飛云,2,王金晶,2,李崎,2,劉春鳳,2*

1(江南大學 生物工程學院,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214222) 2(江南大學,釀酒科學與工程研究室,江蘇 無錫,214222)

熒光探針可針對特定的目標物質產生熒光信號,并達到分析檢測的目的。作為一種重要檢測手段,熒光探針的應用范圍已擴展至化學、環境以及生命科學等,并隨著學科間的交叉不斷拓寬其應用領域。本文主要針對熒光探針在高通量篩選技術上的應用進展進行系統的綜述,分析了這一技術的特點以及存在的問題,為這類快速且高效的篩選技術的進一步應用提供參考依據,對高通量篩選技術的發展具有重要的指導意義。

1 熒光探針簡介

18世紀中期,STOKES首次提出“熒光”的概念,對第一個定義明確的小分子熒光團奎寧的發光過程進行了解釋。1856年,PERKIN成功合成了熒光染料類化合物苯胺紫,拉開了人工合成熒光染料的序幕[1]。1962年,SHIMOMURE等[2]從多管水母屬中分離得到了綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP),GFP作為最早被開發的一類熒光探針在生物醫學領域被廣泛應用[2]。在隨后的發展過程中,熒光探針從GFP向有機小分子熒光探針擴展,第1個有機小分子熒光探針可追溯至20世紀80年代,學者們對熒光探針給出的準確的定義為：熒光探針是一種分子器件,能夠選擇性的與客體分子通過化學或者物理之間的相互作用,產生熒光信號,進而實現定量與定性檢測客體分子的目的。隨著熒光探針檢測技術的不斷發展,針對不同種物質具有功能特異性的熒光探針不斷涌現,在近50年的發展過程中,熒光探針已被應用于生物細胞成像、環境分析、食品科學和醫學等領域。近年來各類新型熒光探針的出現不斷拓寬這一技術的適用范圍,可檢測的物質越來越廣泛,如金屬離子[3]、CO[4-6]、H2S[7]和甲醛[8]等。然而,各領域始終存在對可利用的新型熒光探針的需求,因此,設計并合成新型高效的熒光探針勢在必行。

1.1 熒光探針的組成

熒光探針一般由3個部分構成：熒光基團、識別基團和連接基團,也有一些非典型結構的熒光探針無連接基團部分。

熒光基團可以釋放出熒光信號,實現對目標物質的檢測。熒光基團的性質決定了探針的靈敏度與準確性,常用的熒光基團包括：香豆素類、奈酰亞胺類、羅丹明類、熒光素類、苯并雙噻二唑類和氟硼二吡咯類等[9](圖1)。

圖1 常見熒光團結構Fig.1 The structure of common fluorophores

識別基團對待測物質具有特異性識別功能,識別效果決定了探針的選擇性和特異性。一般情況下,識別基團與待測物可通過弱作用力或化學反應進行結合,作用力包括范德華力、氫鍵、親疏水作用等,化學反應可以是加成反應、氧化還原反應、環化反應等[5]。

熒光探針與目標物相結合后將識別信息經連接基團傳遞給熒光基團,不同種熒光探針連接基團形式多樣,最常見方式是利用共價鍵的形式將熒光基團與識別基團連接起來。

1.2 熒光探針的作用機理

熒光探針的作用機理如圖2所示。隨著研究的不斷深入,有關熒光探針作用機理的研究已經有了很大進展,主要包括以下幾種：

圖2 熒光探針機理示意圖Fig.2 Schematic diagram of fluorescent probe mechanism

(1)分子內電荷轉移(intramolecular charge transfer,ICT)[10]。ICT通過改變電子吸收能力、電子給體或是Π-共軛程度來與目標物相互作用,導致吸收光譜變化,實現發射峰紅移或是藍移,這是目前熒光探針最常依據的原理。依據ICT設計的熒光探針也適用于黏度大的檢測環境。

(2)光誘導電子轉移(photoinduced electron transfer,PET)[11]。電子給體與受體之間通過橋梁連接,探針受光激發后,激發態的電子給體與電子受體之間發生電子轉移,導致熒光猝滅發生；當識別基團與待測物結合后,會減弱識別位點供電子能力,阻斷PET效應,使熒光信號得以恢復。這一機理用于設計開關型熒光探針。

(3)熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)[12]。FRET包括一對熒光團之間的能量轉移,分別為能量供體和受體,當能量的吸收與發射有一部分重疊且距離≤10 nm時,就會發生熒光共振能量轉移。FRET常用于設計比率型熒光探針。

(4)聚集誘導發光(aggregation-induced emission,AIE)[13]。傳統的熒光染料在高濃度時會導致發光猝滅,而AIE分子在聚集狀態時,由于分子的空間位阻作用,非輻射躍遷被阻斷,進而引發聚集誘導發光。依據AIE設計的熒光探針可以解決熒光團濃度過高而導致聚集猝滅的情況。

(5)激發態分子內質子轉移(excited-state intramolecular proton transfer,EIPT)[14]。依據這一機理的熒光探針受到光、熱或電激發后,分子內質子受體和給體間發生質子的轉移。這一類型的熒光探針由于斯托克斯位移較大,可避免在激發過程產生自重吸收和內部過濾,但對環境十分敏感,需要提供疏水的膠束環境,如大量的有機溶劑。

1.3 熒光探針的分類

目前沒有統一的方法將熒光探針進行分類,熒光探針的分類有多種形式,如按照材料、發射峰特性、發射波長以及反應類型等進行分類。雖然目前分類較多,但這些分類方法相互交叉,對熒光探針的設計與制備有一定指導意義。

根據材料的不同可以分為：綠色熒光蛋白、納米材料以及有機小分子熒光探針。有機小分子熒光探針是近年來應用最為廣泛的熒光探針,因其原理清晰、制備較易且成像效果好等優點備受青睞。

另一種常見的分類方式是將熒光探針分為比率型和強度型。強度型熒光探針在檢測過程中有單個發射峰且有猝滅型和增強型2種類型[9]。比率型熒光探針利用2個發射峰的比值變化定量檢測目標物,由于具有自校特點常應用于擾動較大的環境。

其他分類方式：根據發射波長的不同分為可見光熒光探針和近紅外(near infrared,NIR)熒光探針；根據和目標物反應類型的不同分為反應型和配位型；根據熒光探針吸收光子數目不同分為單光子熒光探針、雙光子熒光探針和多光子熒光探針；根據用途的不同分為pH熒光探針、金屬離子熒光探針和核酸熒光探針等；根據檢測樣品種類不同分為生物類和非生物類熒光探針。

2 熒光探針在高通量篩選技術上的應用

高通量篩選技術(high-throughput screening,HTS)自20世紀90年代初次問世以來得到迅猛發展。針對大量待測物的檢測和篩選,更高的篩選通量、更高的篩選效率以及小型化的檢測方法節約了許多時間和成本,極大地提高了科研效率。熒光探針以能夠與靶向目標物結合并發生熒光性質的改變為核心,在高通量篩選技術上的應用越發誘人,并隨著熒光探針技術的發展在各領域有著一定的應用潛力。

2.1 高通量篩選目的菌株

快速高效的高通量篩選系統可以一次性獲得大量信息,菌株的選育離不開高通量篩選技術。例如,熒光探針在高通量篩選含脂質酵母方面應用比較廣泛。SITEPU等[15]為篩選含脂質的酵母樣品,對已有的尼羅紅熒光探針檢測方法進行了改進,改進重點圍繞提高細胞膜通透性等方面,實驗結果表明尼羅紅檢測胞內脂質的效率得到了提升,適當降低尼羅紅的濃度也不會影響檢測結果,整套高通量篩選方法具有高效且低成本的特點。ROSTRON等[16]也將尼羅紅熒光分析法應用于生物技術工業中快速篩選轉基因菌株,在研究中驗證了其在低脂非油脂裂殖酵母野生型和缺失型菌株中脂質含量檢測方面的應用效果。近期也有研究將改進的高通量尼羅紅熒光測定法用于快速篩選含脂質酵母,將固體培養和熒光檢測相結合,使得整個篩選過程更簡便、更高效[17]。除使用尼羅紅作為熒光探針外,CHOI等[18]開發了親脂性熒光染料,用于對細胞內的聚3-羥基丁酸酯進行定量分析,可以染色活菌落,從而可以有效選擇聚3-羥基丁酸酯陽性細胞,且熒光強度保持時間比尼羅紅更長,間接提高了檢測結果的準確性。

尼羅紅熒光探針是典型的親脂性熒光探針,在胞內脂質檢測及含脂質酵母篩選的過程中經歷了熒光分析方法的優化、溶劑的選擇、細胞預處理方式以及探針引入方式的探究等諸多階段。這也為其他熒光探針在高通量篩選方案優化方面提供了一定的參考,如當研究對象為胞內物質時,可能遇到諸如探針的特異性、其他物質的干擾以及熒光強度較弱等問題,此時可參照上述研究中的策略進行方法的調整和優化。值得注意的是,選擇尼羅紅這一經典熒光團設計脂質熒光探針,具有優良性能的熒光團若加以適當的衍生化處理,可以提高與目標物質的特異性結合效率并展示出良好的熒光效果,將為熒光探針的選擇提供一條便捷的路徑。

除了對產脂質酵母進行篩選的應用外,也有研究對高產聚蘋果酸酵母進行高通量篩選,合成了以羅丹明為熒光團的熒光探針,該熒光探針的熒光信號與聚蘋果酸含量之間具有良好的定量關系,可用于評價發酵液中聚蘋果酸的含量[19]。

熒光探針以其較高的靈敏度、反應迅速以及便捷的操作在高通量篩選目的菌株上扮演重要角色,但國內外的研究多集中在產脂質酵母的篩選,不僅很少涉及其他性狀的酵母,而且也沒有其他微生物的應用實例。據熒光探針設計方面的報道來看,各種類型的熒光探針,尤其是針對某種化合物的小分子熒光探針已經有了比較成熟的制備理論和有效性驗證,如硫醇、H2S、CO以及甲醛等[4-5,7,20]。因此可適當拓展高通量篩選目的菌株的實際應用范圍。

2.2 高通量篩選抗生素

pH熒光探針是熒光探針技術的重要應用之一,利用pH熒光探針可以對抗生素藥物進行高通量篩選。基于pH熒光探針篩選抗生素的研究思路為：細菌的生長會使菌液酸化,pH熒光探針的熒光信號會隨著菌液的酸化而減弱,抗生素的加入則會使熒光信號減弱的程度降低。有學者依據該實驗思路成功地制備了pH熒光探針,并在高通量篩選抗生素上進行了應用,PAN等[21]的研究主要集中在探針的水溶性上，SI等[22]開發的熒光探針具有價格低廉、易于合成、高穩定性、無毒且易于與基質相結合的特點，設計的熒光探針適用于實時監測細胞酸化以及抗生素高通量篩選。

以上兩者的研究更注重探針的實際應用,也有研究注重于探針設計,并展示出探針在高通量篩選抗生素上的應用潛力。葉文等[23]制備了可以實時監測pH的聚合物pH熒光探針并組合在微型反應器上,在高通量篩選抗生素方面具有應用價值。OTA等[24]開發了一種基于FRET的核酸探針,該探針被源自液滴中細菌的核糖核酸酶裂解,導致熒光強度增加,實驗結果表明該檢測方法具有高通量篩選抗生素的潛力[24]。

細菌菌液濃度通常用OD值表示,而熒光探針技術則具有較高的靈敏度,可在細菌生長至平衡期時更好地體現細胞代謝的變化,熒光探針展示出其在高通量篩選過程中的“高質量”。熒光探針在高通量篩選抗生素應用的同時揭示了通過pH變化來篩選目標物的巨大潛力,例如將細菌的新陳代謝活動作為它們對抗菌藥物敏感性的指標,可篩選新的生長抑制劑。

2.3 高通量篩選酶抑制劑

熒光探針在高通量篩選酶抑制劑方面有著廣泛的應用。其原理與篩選抗生素類似,都是通過監測外源物質的引入對熒光信號的影響來實現篩選的目的。首先設計并制備一種與目標酶進行特異性結合的熒光探針,篩選過程中對熒光有抑制或增強作用的化合物則為酶抑制劑,也可以使用適當的函數對抑制率進行表達。

LI等[25]開發了一種熒光探針來檢測內源性細菌青霉素G酰基轉移酶(penicillin G acylases,PGA),使用基于新型熒光探針的高通量篩選技術,發現齊墩果酸是潛在的PGA天然抑制劑,精確測定各種細菌的內源PGA活性也為高通量篩選產PGA菌株提供依據。XU等[26]合成了2種谷氨酰胺酶(glutaminase,GLS)熒光探針,對構建的含有三唑基的化合物文庫進行交叉篩選,結果表明引入三唑基團可以抑制GLS活性。此外,也有研究報道了利用熒光探針高通量篩選15-脂氧合酶、單酰基甘油脂肪酶、N-乙酰基轉移酶2以及胱硫醚β-合酶抑制劑的應用[27-29]。總之,抑制劑和熒光探針之間競爭酶的作用位點,將熒光信號的變化作為篩選的依據,與通過測定酶活力來篩選抑制劑相比優勢明顯。值得注意的是,制備的熒光探針可以針對特定的一種酶或多種酶,其他類型的熒光探針也是如此,設計出針對某一種特定物質的熒光探針實際上是有難度的,需要考慮熒光基團與待測物的專一性,根據研究目的也可以設計某一類帶有相同的基團的熒光探針。

有部分研究側重目標酶熒光探針的設計,涉及的酶包括金屬蛋白酶-整聯蛋白15、囊泡單胺轉運體2以及膜蛋白,研究重點闡述了熒光探針的合成原理、合成路線以及功能表征,展示出在高通量篩選酶抑制劑上的應用前景[30-32]。制備理論的形成是突破性的一步,但還需要實際應用來考察技術的實用性。

2.4 其他高通量篩選技術上的應用

除高通量篩選目的菌株、酶抑制劑和抗生素外,熒光探針技術在其他高通量篩選技術方面也有一定應用。ZHANG等[33]報道了一種新的膽固醇熒光探針,當以高通量形式使用熒光探針時,可在短時間內檢測對膽固醇有影響的化學物質,這種膽固醇熒光探針提供了一種安全、靈敏且可重現的策略。ZHENG等[34]開發了熒光高通量篩選方法測定脂肪酶的酯交換活性,用酶標儀在96孔微孔板中可檢測熒光物質濃度,日篩選樣品量可達9 200個。兩者的研究都是在已具備一定高通量篩選技術的基礎上進行的方法優化,熒光探針則為優化方案中的關鍵。在驗證過程中發現,熒光探針篩選方法不僅與傳統篩選方法結果趨于一致,更重要的是檢測過程簡單、靈敏度高、試劑廉價且對儀器要求低。

此外,高通量自動流動方法測定透析濃縮液中的痕量鋁、高通量篩選環境樣品中的甲狀腺激素破壞性化合物以及高通量篩選動物毒液等,都展示出熒光探針在高通量篩選技術上良好的應用效果[35-37]。國內的研究則主要集中在醫藥方面的應用。蘭小紅等[38]使用3種熒光探針建立了腎保護活性物質的篩選方法,運用高通量方法先對化學組分進行篩選,再結合液相色譜質譜聯用得到具體的目標物質,所建立的方法穩定且可靠。吳雪莉等[39]對中成藥消渴安中二肽基肽酶-4抑制劑進行篩選,發現丹酚酸C等對二肽基肽酶-4具有抑制作用,為了得到具體的物質,同樣需要結合液相色譜質譜聯用的方式,為篩選藥物中藥效物質提供了實例,同時也是熒光探針在高通量篩選酶抑制劑方面的應用。

3 結論與展望

熒光檢測技術是高通量篩選重要的方法之一,發展高通量篩選技術符合現代對科研效率的要求,熒光探針依靠與目標物特異性結合實現熒光信號的轉變,極大地提高了篩選效率。目前已有多種熒光探針的設計方案被報道,尤其是有機小分子熒光探針具有廣闊的應用前景。通過對近年來將熒光探針技術應用于高通量篩選的研究進行整理,可以投入實際應用的熒光探針主要包括以下特點：(1)無需繁瑣的合成路線,有機小分子熒光探針在這一點上有一定優勢；(2)熒光探針作用于目標物時具備良好的相容性,熒光信號作為篩選依據靈敏度高且有效；(3)特異性強,尤其對于檢測環境復雜或是體系中存在與目標物官能團相同的物質,低選擇性會使高通量篩選效率降低。

隨著熒光探針技術的不斷發展,學者們將熒光探針技術投入到高通量篩選的實際應用上來,但在應用過程中還存在一定的問題：(1)其他物質會對反應型熒光探針的作用效果造成干擾,提高選擇性,實現熒光探針與目標物的特異性結合仍是亟待解決的問題；(2)熒光探針的設計與制備需要進行大量的理論研究和驗證實驗,且常涉及到學科交叉,為了獲得合適的熒光探針一般需要對多種熒光探針進行試驗,方法應用高效但前期準備工作量大；(3)除具備實驗條件可自行制備熒光探針的研究外,目前一些將熒光探針應用至高通量篩選技術上的研究需要從已成功制備的熒光探針中進行篩選,識別基團作為主要的選擇依據常會伴隨著特異性、靈敏度以及可視化等問題,一定程度上制約了技術的應用進程。

在食品發酵領域,利用熒光探針可對微生物發酵過程中產生的風味物質等進行檢測,判斷熒光信號的強弱可實現對目的菌株的高通量篩選,在篩選優良菌株方面具有應用潛力。在食品檢測分析領域,熒光探針可作為一種環境友好型檢測方法,避免使用大量的有機溶劑,減少對人體和環境的潛在不利影響,綠色檢測方法的應用可在真正意義上做到從源頭杜絕食品污染。熒光探針檢測方法步驟簡便且檢測效率高,具有快速性、準確性及科學性等突出特點,滿足當下食品安全檢測需求,為食品中有毒有害物質的檢測提供了有效方法。此外,熒光探針是一種功能性較強的檢測分析工具,快速檢測試劑盒的研發則可以提高實際應用的效率,實現在食品加工、保藏、貯運以及市場監控等方面的高效快速檢測。本文為熒光探針應用至高通量篩選領域提供了一定線索,特別是對探針選擇以及篩選思路的構建進行了分析和闡述。