致病性大腸桿菌全基因組測序及毒力基因分析

周 倩，王嘉福*，冉雪琴，牛 熙，黃世會

1.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽 550025；2.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025

大腸桿菌存在于人和動物腸道中[1]，某些大腸桿菌是導致仔豬腹瀉的主要病原菌之一[2]，其導致的疾病發病率高、發病急、死亡率高、涉及范圍廣，給養豬業造成巨大經濟損失，嚴重影響了養豬業的發展[3]。然而由該菌引發的疾病目前缺少有效的治療手段，臨床上主要以母體抗原、抗血清、抗生素等為主，容易產生耐藥性、藥物殘留等問題[4-5]。

大腸桿菌通過黏附素黏附于斷奶仔豬小腸上皮細胞，就定居在小腸上并開始大量繁殖并產生毒素，產生的毒素被吸收后，引起胃腸道血管、皮下組織和腦血管的損傷，從而使宿主發生一系列疾病[6]。致病性大腸桿菌侵襲宿主組織引起其發病的過程是由多種毒力因子相互協調而發揮作用，大腸桿菌的主要毒力因子包括毒素、黏附素、外膜蛋白、鐵轉運系統和吸收系統等[7]。為研究致病性大腸桿菌致病力差異的原因，采用二代高通量測序技術對7株不同致病力的大腸桿菌進行全基因組測序，分析毒力基因的差異，以期解析大腸桿菌的致病因子和致病機制。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株P211、P555、P32、P444和P111由本實驗室從貴州某豬場腹瀉仔豬糞樣中分離，菌株S10670、E24190購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。40只SPF級小鼠購自北京斯貝福生物技術有限公司。

1.2 菌株純化鑒定

使用EMB、MAC和LB固體培養基對7菌株進行純化，隨后對菌株進行革蘭氏染色鏡檢和生理生化鑒定，再用細菌16S rDNA基因通用引物27F和1 492R進行擴增(表1)，擴增產物進行Sanger測序，用NCBI網站對測序產物進行Blast同源比對，對菌株進行分子系統學鑒定。

表1 細菌16S rDNA擴增引物

1.3 小鼠致病性試驗

挑取單個純化后的7株菌株于LB液體培養基中培養至濃度為1×108CFU/mL的菌懸液，將40只小鼠隨機分為8組，7個實驗組和一個對照組，每組5只小鼠，實驗組小鼠的給藥途徑、給藥方法和給藥劑量參照《藥理實驗方法學》的動物實驗技術進行[8]，按照10 g/0.2 mL 的劑量腹腔注射菌懸液，對照組則按照10 g/0.2 mL 的劑量腹腔注射生理鹽水。正常飼喂，自由飲水，感染后觀察48 h，記錄小鼠臨床癥狀和死亡時間，死亡小鼠及時剖檢觀察內臟組織病變并制作病理切片，觀察病理變化。

1.4 測序樣品

挑取單個純化鑒定后的菌株用LB液體培養基中培養于37 ℃、160 r/min培養過夜后收集菌體，使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組，經酶標儀及1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度、純度均達到基因組DNA 的測序要求后進行全基因組測序。測序工作由華大深圳股份有限公司完成，測序平臺為DNBSEQ。

1.5 基因文庫構建

將基因組DNA的大片段隨機打斷獲得200 bp～400 bp的DNA片段，然后修復雙鏈DNA末端，并在3'末端加上A堿基，配制接頭連接反應體系使接頭與DNA連接，擴增連接產物并純化回收，將PCR產物變為單鏈后，配制環化反應體系，得到單鏈環形產物，消化掉未被環化的線性DNA分子后，即得到最終的文庫。

1.6 全基因組測序與基因組組裝

檢測合格文庫安排上機測序(DNBSEQ)：單鏈環狀DNA分子通過滾環復制，形成一個包含300多個拷貝的DNA納米球(DNB)。將得到的DNBs采用高密度DNA納米芯片技術，加到芯片上的網狀小孔內。通過聯合探針錨定聚合技術(cPAS)進行測序。得到測序原始數據后，對raw reads過濾質控，去除低質量reads以及adapter和duplication污染后，從而得到高質量Clean Reads后，采用SOAPdenovo[9]組裝軟件進行序列組裝,通過不斷優化參數Kmer值為15獲得最好的組裝結果。

1.7 基因預測及注釋

采用Glimmer 3.02[10]進行組裝結果的基因預測，分別采用RNAmmer-1.2[11]和tRNAscan-SE[12]軟件對基因組中包含的rRNA和tRNA進行預測。將預測基因的氨基酸序列與eggNOG(http://eggnog-mapper.embl.de/)[13]數據庫和VFDB(https://card.mcmaster.ca)[14]數據庫進行BLAST比對，將得到的基因進行功能注釋，獲得COG注釋信息和菌株毒力基因，并對COG注釋結果進行統計和分類,通過VFBD數據庫注釋到的毒力因子，分析不同致病力菌株的毒力基因差異。

2 結果

2.1 菌株的鑒定

2.1.1菌落形態特征

7株菌株在MAC瓊脂平板上形成圓形、表面光滑、濕潤的粉紅色菌落(圖1A)；在EMB瓊脂培養基上形成表面光滑、凸起、帶黑色金屬光澤的菌落(圖1B)；在LB固體培養基上形成圓形、表面光滑、半透明的乳白色菌落(圖1C)；革蘭氏染色，鏡檢可見紅色短桿菌、中等大小、兩頭鈍圓、呈單個或多數散在排列(圖1D)，鑒定結果均與大腸桿菌形態特征相符。

A

2.1.2生理生化鑒定

7株菌株均能發酵葡萄糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖，尿素、蛋白胨水、乙酰甲基甲醇(V-P)、Koser肉湯、氧化酶、硫化氫試驗陰性，甲基紅試驗(MR)陽性，具有動力，結果顯示該7株菌與大腸桿菌具有相似的生理生化特性(表2)。

表2 7株菌株生理生化鑒定結果

2.1.3分子生物學鑒定

菌株16S rDNA基因經PCR擴增獲得1 500 bp的片段，與預期相符(圖2)，將16S r DNA基因序列與NCBI核酸數據庫比對，7株菌株與已知大腸桿菌的相似性最高，均在99.5%以上，將7株菌株鑒定為大腸桿菌。

注：M：D 2 000 DNA marker ;1.S40670;2.E24190;3.P211;4.P555;5.P32;6.P444;7.P111圖2 16S rDNA基因擴增結果

2.2 小鼠致病性試驗

7株菌株用相同濃度(1×108CFU/mL)的菌懸液對小鼠進行感染試驗，結果顯示(表3)，48 h后S10670和E24190實驗組小鼠死亡5只，病死率為100%，P211和P555實驗組小鼠死亡2只，病死率為40%，P32、P444和P111試驗組小鼠死亡1只，病死率為20%，對照組小鼠全部存活。因此，將菌株S10670和E24190歸為強毒株，P211和P555定為中等毒株，P32、P444和P32為弱毒株。感染后的小鼠出現背毛聳亂無光澤，進食少，活動緩慢，精神萎靡不活躍，倦怠、嗜睡，并且扎堆出現，對外界刺激遲鈍，其中S10670和E24190組臨床現象最嚴重，重度腹瀉，接種菌株S10670的小鼠還有眼角包裹著眼屎，眼部出現水腫現象；P211和P555臨床現象次之，P32、P444和P111臨床現象最弱。

表3 小鼠致病性試驗結果

2.3 剖檢和組織病理學觀察

對死亡小鼠進行剖解后(圖3)觀察小組內臟組織，與對照組相比實驗組小鼠內臟組織出現不同程度的病變，表現為心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟腫大充血，顏色變深；腸道變薄，內有大量內容物，且味道惡臭。病理切片顯示(圖4)，實驗組小鼠心臟組織心肌纖維紊亂、排列不整齊，部分出現斷裂崩解伴有出血；肝臟組織出現充血，細胞腫大，局部呈紅色塊狀，組織界限模糊；脾臟組織出現充血；肺臟組織部分輪廓不清晰，出血，肺泡腔內有紅細胞，肺泡壁增厚；腎臟組織出現充血，腎小球結構不明顯；腸上皮細胞受損、腫大，腸黏膜壞死，腸絨毛脫落。其中組織病變和病理現象強毒株病變最嚴重，中等毒株次之，弱毒株最不明顯。

心

圖4 組織切片圖

2.4 基因組組裝

對測序數據進行質量評估和組裝，由結果可得菌株S10670、E24190、P211、P555、P32、P444和P111組裝后得基因組大小依次為5.3 Mb、5.1 Mb、4.7 Mb、4.8 Mb、4.9 Mb、4.8 Mb和4.6 Mb，GC含量均在50%左右，基因組大小和GC含量均在大腸桿菌基因組大小和GC含量的正常范圍，其它詳細信息見表4，組裝結果可知菌株S10670的基因組最大。

表4 基因組組裝結果

2.5 基因預測

對組裝好的序列進行基因組成分析，菌株S10670、E24190、P211、P555、P32、P444和P111采用Glimmer軟件預測基因數量分別為5 124、4 936、4 563、4 601、4 762、4 724和4 376，用rRNAmmer1.2軟件預測出的rRNA數量依次為9個、9個、5個、5個、3個、3個和7個，tRNAscan軟件預測出的tRNA數量依次為85個、74個、75個、66個、77個、70個和74個，基因、rRNA、tRNA數量和GC含量均符合大腸桿菌基因組的基本特征(表5)。

表5 基因預測結果統計

2.6 COG功能注釋

本研究7株菌株基因的COG分類得到22類，菌株S10670、E24190、P211、P555、P32、P444和P111注釋到的功能基因數量分別為3 482個、3 483個、3 274個、3 286個、3 342個、3 341個和3 183個。由圖5可知，注釋到的與代謝相關基因的數量最多。

圖5 COG注釋分類統計

2.7 VFDB注釋

通過與毒力因子數據庫(VFDB)比對，菌株S10670、E24190、P211、P555、P32、P444和P111注釋到的毒力基因數量分別為126、61、52、55、47、44、38個，其中分泌系統和黏附與侵襲毒力基因最多。由表6可知，強毒株S10670的基因組中含有志賀毒素基因(Stx)，溶血素基因(hlyA,hlyB,hlyC,hlyD,hlyE/clyA)，黏附相關的毒力基因有外膜蛋白黏附素基因(paa)、緊密黏附素基因eae、緊密黏附素易位受體蛋白基因Tir、toxB，血紅素吸收相關基因(chuA,chuT,chuW,chuX,chuY)，大量III型分泌系統相關基因如NLE系列基因(nleA,nleB1,nleB2-1,nleC,nleE-1,nleF,nleG-1,nleG2-3,nleG7,nleH1-1,nleH1-2)、Esp系列基因(espB,espF,espG,map,tir,espJ,espL1,espL2,espL4,espM1,espR1,espR3,espR4,espW,espX1～espX6,espY1～espY5)、Esc系列基因(escC,escD,escF,escJ,escL,escN,escO,escR,escS,escT,escU,escV)和VI型分泌系統相關基因(aec15～aec19,aec22～aec32)；強毒株E24190基因組中含有腸毒素基因(LT)、溶血素基因(hlyA)和CFA/I菌毛相關基因(cfaA,cfaB,cfaC,cfaD/cfaE)；中等毒株P211基因組中含有CFA/I菌毛相關基因(cfaA,cfaB,cfaC,cfaD/cfaE)、P菌毛相關基因(papA,papC,papD,papH)和鐵轉運系統吸收系統相關基因(sitA,sitB,sitC,sitD)；中等毒株P555基因組中含有12個VI分泌系統相關基因(aec15～aec19,aec22～aec32)；弱毒株P32、P444和111基因組中含有的毒力基因也存在于菌株S10670、E24190、P211和P555中，如黏附相關毒力因子大腸桿菌普通菌毛(ECP)、大腸桿菌層粘連蛋白結合蛋白菌毛(ELF)、出血性大腸桿菌菌毛(HCP)和I型菌毛(Fim)，侵襲素相關毒力因子(ibeB,ibeC)，鐵轉運系統相關毒力基因(entA,entB,entC,entE,entS,hitC)分泌系統相關毒力基因(espL1,espL4,espR1,espX1,espX4,espX5,aec15)和溶血素基因(hlyE/clyA)。

表6 毒力因子統計

3 討論與結論

大腸桿菌的致病性是由多種毒力因子互相協作產生。志賀樣毒素(Stx)是一種志賀毒素,具有細胞毒性、腸毒性、神經毒性作用，是毒性最強的細菌毒素之一，包括Stx1和Stx2兩種亞型，Stx2較Stx1的毒力更強，Stx2的變異體Stx2e是導致仔豬發生水腫病的重要毒素[15]。緊密黏附素eae能使細菌緊密黏附到腸上皮細胞，eae與緊密黏附素易位受體蛋白Tir結合引起進一步的信號傳導，細胞內鈣離子濃度驟增，腸內液體分泌增加，引起特征性的粘附脫落病變(attaching and effacing,A/E)[16,17]。Chu系列基因編碼的蛋白與血紅素的吸收有關，血紅素是宿主體內最豐富的鐵離子資源，主要由chuA基因從細胞外或者宿主的血紅素中攝取鐵和血紅蛋白中的鐵元素[18]。溶血素(Hemolysin)基因(hlyA,hlyB,hlyC,hlyD,hlyE/clyA)孔道形成蛋白家族的成員，溶血素可溶解哺乳動物紅細胞，在靶細胞膜上形成孔道繼而殺死靶細胞[19]。Ⅲ型分泌系統效應因子( Non-LEE encoded effactor ，Nle ) NleH和NleD具有抗凋亡活性，NleH能夠促進細胞的生存，抑制腸細胞的丟失，從而維持大腸桿菌的定值[20]。在感染期過程中，大腸桿菌表面分子能夠誘導外源性的細胞凋亡，Ⅲ型分泌系統效應因子如EspF，Map能夠誘導內源性的凋亡途徑[21]。EspF能夠誘導線粒體的溶解﹑破壞細胞緊密聯接結構和促進抗凋亡蛋白的降解[22]。Map能夠破壞細胞之間的緊密聯結，誘導線粒體功能失活[23]。毒力因子Stx、eae、Tir、Chu、hlyB、hlyC、hlyD和III型分泌系統相關基因Nle、EspF 、Map在本研究中僅存在于強毒株S10670中，hlyA存在于強毒株S10670和E24190中。熱敏腸毒素(LT)為一種免疫蛋白，與霍亂腸毒素(CT)有著密切關系，組成一個毒素家族，LT是產腸毒素大腸桿菌的主要致病因子之一，可引起水樣腹瀉[24]。LT在本研究中僅存在于強毒株E24190中。

VI型分泌系統(T6SS)是一種新型的分泌系統，普遍存在于革蘭氏陰性菌中，最早是在霍亂弧菌中發現的，T6SS參與細菌生物膜的形成，并介導細菌與宿主之間的粘附和毒性作用[25]，本研究檢測到的VI分泌系統是ACE T6SS相關毒力因子。ACE T6SS僅存在于強毒株S10670和中等毒株P555中。CFA/I是一種優勢血清型定居因子，整個CFA/I定居因子由4個基因 (cfaA,cfaB,cfaC,cfaD/E) 編碼[26,27]，編碼的相應多肽稱為cfaA,cfaB,cfaC,cfaD/E，成熟定居因子由cfaB和cfaE組成，cfaB是主要結構亞單位，cfaE位于定居因子頂端,二者均能介導CFA/I對人小腸上皮細胞相應受體的結合，致病性大腸桿菌通過其菌體表面的宿主特異性定居因子CFA/I介導粘附于小腸黏膜上皮細胞[28]，大量增殖,釋放腸毒素，引起仔豬腹瀉，CFA/I在本研究中存在于強毒株E24190和中等毒株P211中。

P型菌毛多分布于尿道致病性大腸桿菌(UPEC)的黏附素，能介導大腸桿菌粘附于上尿道，P型菌毛是UPEC導致腎盂腎炎的主要毒力因子，已知的編碼P菌毛操縱子的基因有papA、papB、papC、papD、papE、papF、papG、papH和papI，其中 PapA 蛋白是 P 菌毛的主要成分[29]。鐵/錳轉運蛋白(Iron/manganese transport)是鐵攝取轉運系統毒力因子，由sitA、sitB、sitC和sitD四個基因編碼組成，該系統中的sitB是ATP結合蛋白，所以該系統相當于是ATP離子泵，可以提供細菌轉運過程所需的能量，外膜轉運系統還可以將二價鐵載入細胞內，參與營養物質的攝取、細菌毒素的分泌以及將抗生素泵出細胞使細菌具有抗藥性[30]。P菌毛和鐵/錳轉運蛋白本研究中僅存在于中等毒株P211中。

綜上所述，本研究通過細菌感染小鼠鑒別7株菌株的致病力，采用二代測序技術測定7株致病性大腸桿菌的基因組序列，經組裝，得到致病力相關的毒力基因，研究結果為大腸桿菌分子致病機制奠定理論基礎。