龍膽酵素的發酵工藝優化及其生化功效研究

陶宏兵，楊 娟，鄧小鋒，葉子翠，施慶珊，謝小保，黃小茉*

1.廣東迪美新材料科技有限公司,廣東 肇慶 526238;2.廣東省微生物研究所 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室,廣東 廣州 510070

龍膽草(Gentiana Scabra Bge)又名龍膽、地龍膽、草龍膽，為龍膽科植物。據《神農本草經》記載，龍膽“主骨間寒熱，驚癇邪氣，定五臟，殺蠱毒。”2015版《中國藥典》一部明確，龍膽草“清熱燥濕，瀉肝膽火”。我國龍膽產業規模化、產品系列化正在形成，傳統產品形式主要為藥用，起到抗菌、抗炎、健胃等功效[1,2]。近年隨著化妝品原料越來越崇尚天然，龍膽在化妝品中的應用越來越多[3]。目前國內化妝品植物原料應用的較多的是以提取物形式加入，由于工藝的限制，提取物有效成分含量低，功效無法保證，且提取過程會添加較多醇類，違背了天然原料的初衷[4,5]。

本研究以龍膽草為發酵底物，利用微生物的發酵代謝作用，以龍膽苦苷為評價指標，對龍膽草進行深層次的加工制備成龍膽酵素，采用自由基清除和透明質酸酶抑制試驗，驗證其功效，為豐富龍膽草資源的化妝品應用及酵素新產品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍膽草：產自云南昆明；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCC 2.3853:廣東省微生物菌種保藏中心；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CICC 21790：中國工業微生物菌種保藏中心。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(yeast extract peptone dextrose，YPD)，LB培養基，廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

WJS1222F榨汁機，美的電器公司；UV200紫外分光光度計，廣州昂科生物科技有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋，上海琪特分析儀器有限公司；IS-RDS4恒溫搖床，廣州儀新生物科技有限公司；TG16-WS臺式高速離心機，上海恒科儀器有限公司，LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1龍膽酵素的制作

制作工藝：選取新鮮龍膽草，粉碎，按照料液比1∶10加入YPD培養基后滅菌，接入菌種發酵，靜置澄清，上清離心過濾得到龍膽酵素。

1.3.2龍膽酵素發酵工藝優化正交試驗

考慮各因素之間的交互影響，選擇L9(33)正交表，以A菌株菌株組合(釀酒酵母，植物乳桿菌，釀酒酵母+植物乳桿菌)、B發酵溫度(28 ℃，30 ℃和32 ℃)、C發酵時間(24 h，48 h和72 h)，設計3個因素3水平正交試驗對發酵培養后龍膽酵素中的龍膽苦苷含量進行評價。

1.3.3龍膽苦苷含量測定

參照《中國藥典》2015版[6]，通過高效液相色譜法進行檢測。色譜柱Aglient TC-C18柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)；流動相：水-甲醇(75∶25V/V)，檢測波長為270 nm；檢測器：二極管陣列檢測器。

1.3.4透明質酸酶抑制試驗[7]

取0.1 mL 0.25 mmol/L CaCl2溶液和0.5 mL透明質酸酶37 ℃保溫培養20 min，加入樣品液0.5 mL，37 ℃保溫培養20 min，加入0.5 mL透明質酸納液，37 ℃保溫培養30 min，常溫放置5 min；加入0.1 mL 0.4 moL/L NaOH溶液和0.5 mL乙酰丙酮溶液，置于沸水中加熱15 min后立即用冰水冷卻5 min，加入埃爾利希試劑1.0 mL，放置20 min顯色，用紫外分光光度計測定其吸光度值。

1.3.5自由基清除試驗[8]

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

配置0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，用蒸餾水稀釋樣品成不同體積分數(4%～28%)的待測樣。在酶標板上，加入100 μL DPPH溶液和100 μL梯度樣品溶液，混勻，室溫避光靜置30 min，于λ=517 nm處測OD值。以無水乙醇作為空白對照，Vc(0.01 mg/mL～0.07 mg/mL)為陽性對照。

1.3.5.2 ·OH清除能力

對于范疇中心成員的確定，研究者有著不同的見解，其中宗守云(2011)在對“副”對名詞性成分的選擇和量詞范疇化的中心成員的研究中，得到中心成員的確定有著下四個特征標準：(1)中心成員類別的出現頻率很高；(2)從語言發展上看，中心成員類別在歷史上出現最早；(3)從性質上看，它們是最簡單最和諧的相配，具有簡單性、具體性和客觀性特征，在認知上處于中心地位；(4)從交際上看，范疇中心所代表的事物都是穩固的，常用的事物，在思維上具有優先性特征。這四個特征皆是從具體語料出發，從歷時和共時兩個維度結合人的認知方式概括得出。因此，范疇中心是一個范疇最本質的特征，有了這些特征才能開始去研究其擴展和非典型成員。

將樣品稀釋成不同體積分數(8%～56%)的待測樣。取50 μL 6 mmol/L FeSO4溶液，50 μL 6 mmol/L H2O2溶液，200 μL 龍膽酵素溶液，搖勻，靜置10 min，再加入50 μL 6 mmol/L水楊酸溶液，50 μL體積分數70%乙醇，搖勻，37 ℃反應30 min。于λ=510 nm處測OD值。用體積分數70%乙醇調零，Vc(0.01 mg/mL～0.07 mg/mL)為陽性對照。

將樣品稀釋成不同體積分數(10%～70%)的待測樣，取0.5 mL樣品溶液與1.5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCI緩沖液(pH 8.2)混合，25 ℃水浴20 min，然后加入0.2 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚，反應4 min，取濃鹽酸0.25 mL終止反應。于λ=325 nm處測OD值。

2 結果與討論

2.1 不同發酵條件對龍膽酵素中龍膽苦苷含量的影響

為確定龍膽酵素發酵的各個關鍵參數，選擇菌株組合(A)、發酵溫度(B)及發酵時間(C)，進行3因素3水平L9(33)正交試驗，以龍膽苦苷含量作為龍膽酵素發酵工藝參數的評判指標，結果見表1。

表1 龍膽酵素發酵工藝優化正交試驗結果

菌株組合、發酵溫度及發酵時間這3個因素對應的極差(R)為RC>RB>RA，從而得知影響龍膽酵素發酵的主次因素為發酵時間>發酵溫度>菌株組合。由極差分析可知，龍膽酵素發酵的最佳方案為A3B2C2，即發酵菌株為釀酒酵母+植物乳桿菌、發酵溫度為30 ℃、發酵時間為72 h。在此條件下重復驗證3次，結果表明，龍膽酵素的龍膽苦苷含量達(1 823±21)μg/mL，此條件下的酵素營養、抗敏舒緩效果更佳。

2.2 龍膽酵素對透明質酸酶的抑制作用

圖1 龍膽酵素對透明質酸酶的抑制作用

透明質酸酶是能特異性分解透明質酸(HA)的一種蛋白水解酶。HA是構成細胞外和細胞間基質的主要成分，被分解后會引起細胞脫顆粒和介質滲漏，導致速發型過敏反應的發生。龍膽酵素可以抑制透明質酸酶活性，減少HA的分解，具有一定的抗敏止癢的功效[9]。

2.3 抗氧化能力

2.3.1DPPH清除能力

DPPH是一種穩定的氮中心自由基，在517 nm處有較強吸收值，通常被用來評估檢測物質的抗氧化性[10]。IC50指自由基清除率為50%時對應的樣品濃度，該值與物質的抗氧化能力呈反比關系。圖2為不同濃度的龍膽酵素對DPPH自由基的清除能力。龍膽酵素對DPPH自由基清除率從23.5%上升到77.5%。經計算，龍膽酵素DPPH自由基的IC50為5%。PHILIPPE M等[11]研究表明，發酵物質對自由基清除率表現出差異受原料、微生物和發酵液代謝產物的影響。

圖2 龍膽酵素對DPPH自由基清能力

圖3 龍膽酵素對·OH自由基清能力

圖4 龍膽酵素對自由基清能力

在體外抗氧化能力試驗中發現，龍膽酵素的抗氧化活性較好。這可能是因為，在發酵過程中，龍膽酵素本身含有抗氧化成分如Vc等。除此之外，發酵過程中微生物使原料中的功能成分進行轉化，多種功能成分的協同作用使其總抗氧化活性增強，但其具體的生理作用仍需進一步的研究。

3 結論