唾液乳桿菌電轉化效率優化研究

張曉宇，王 慧，楊昳津，熊智強，夏永軍，王光強，艾連中，宋 馨

上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海 200093

唾液乳桿菌(L.salivarius)是美國FDA認證的GRAS(generally recognized as safe)微生物，存在于人的口腔、腸道、陰道、糞便，以及部分動物(如雞、豬等)的腸道內[1-3]。作為益生菌，唾液乳桿菌耐酸、耐膽鹽、高產胞外多糖，對腸道上皮細胞有較強粘附作用，能促進機體免疫系統的形成，增強腸道屏障功能[4-8]。唾液乳桿菌還對宿主健康具有重要意義。通過產生類細菌素，可抑制金黃色葡萄球菌誘導的咽炎損傷，避免食源性致病菌單增李斯特菌的感染等；通過拮抗作用可抑制致病菌在腸道內定殖，降低幽門螺桿菌活性,減少胃炎發生[9-12]。

目前的研究大多針對唾液乳桿菌的分離鑒定及益生特性，通過分子生物學解析其代謝物和代謝途徑的研究相對較少，這在一定程度上限制了唾液乳桿菌的開發利用，其主要原因是缺乏遺傳操作工具。唾液乳桿菌為革蘭氏陽性菌，細胞壁厚，這導致外源DNA轉入唾液乳桿菌的效率較低[13]。為便于從基因水平對唾液乳桿菌進行研究，需要對其電轉化方法進行優化。

本研究使用單因素法，分別從細菌的培養狀態，甘氨酸濃度、蔗糖濃度，電壓及復蘇時間等方面對唾液乳桿菌的電轉化方法進行優化，從而提高唾液乳桿菌的電轉化效率，為唾液乳桿菌基因工程奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株和質粒

唾液乳桿菌(LactobacillussalivariusAR612)由本實驗室分離并保藏。

pNZ44質粒(乳桿菌穿梭質粒)由本實驗室保藏。

1.1.2培養基和緩沖液

MRS培養基(g/L)：酪蛋白胨 10、牛肉浸出粉 10、酵母浸粉5、葡萄糖 20、磷酸氫二鉀 2、檸檬酸氫二銨 2、三水乙酸鈉 8.3、七水硫酸鎂 0.58、一水硫酸錳 0.25、吐溫-80 1，固體培養基另加瓊脂粉20。

SGMRS培養基：含10 g/L甘氨酸和0.3 mol/L蔗糖的MRS培養基。

復蘇培養基：含MgCl220 mmol/L和CaCl22 mmol/L的MRS培養基。

緩沖液Ⅰ：蔗糖0.3 mol/L、MgCl21 mmol/L、KH2PO45 mmol/L。

緩沖液Ⅱ：蔗糖0.3 mol/L、MgCl21 mmol/L、KH2PO45 mmol/L、150 mL/L甘油。以上緩沖液均用去離子水配置。

1.1.3儀器與試劑

質粒提取試劑盒(Axygen公司)；電轉杯(Bio-Rad公司)；超微量分光光度計(NanoDrop 2000c，Thermo Scientific公司)；電轉儀(MicroPulser，Bio-Rad公司)；生化培養箱(美藍飄爾(上海)過濾設備有限公司)；紫外可見分光光度計(UV-2600，尤尼柯(上海)儀器有限公司)；分析天平(ML104/02，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；電子天平(G2202L-1SCN，賽多利科學儀器(北京)有限公司)；冷凍離心機(3-18K，Sigma公司)；離心機(1-14，Sigma公司)；全自動生長曲線分析儀(Bioscreen C，Bioscreen公司)。

1.2 方法

1.2.1質粒提取

pNZ44質粒提取按照試劑盒說明書進行。使用超微量分光光度計測定質粒濃度。

1.2.2菌種活化及生長曲線繪制

唾液乳桿菌在MRS固體培養基上劃線培養，挑取單菌落接入MRS液體培養基，37 ℃過夜培養?；罨蟮木喊?%接種于MRS培養基，37 ℃培養16 h，使用生長曲線分析儀測定并繪制生長曲線。

1.2.3唾液乳桿菌感受態制備

唾液乳桿菌挑取單菌落接入MRS液體培養基，37 ℃過夜培養。按1%接種量接入50 mL SGMRS培養基，37 ℃培養一定時間后將菌液移入預冷的50 mL離心管，4 ℃ 6 000 g，離心10 min，收集菌體，棄上清。緩沖液Ⅰ洗滌菌體，4 ℃，6 000 g，離心10 min，棄上清。該步驟重復2次。用1 mL緩沖液Ⅱ重懸菌體，按每管100 μL分裝至1.5 mL EP管，-80 ℃凍存。

接種于SGMRS培養基的菌液分別培養至OD600為 0.1、0.2、0.3、0.4和0.5時，按上述方法制備唾液乳桿菌感受態細胞。SGMRS培養基中，甘氨酸濃度分別為0 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L和30 g/L時，以及蔗糖濃度分別為0 mol/L、0.1 mol/L、0.3 mol/L和0.5 mol/L時，分別按上述方法制備感受態細胞。

1.2.4唾液乳桿菌電轉化

唾液乳桿菌的電轉化參考文獻方法并作適當修改[14]。具體如下：從-80 ℃箱中取出唾液乳桿菌感受態細胞，置于冰上解凍，100 ng pNZ44質粒與100 μL 感受態細胞混合，轉移至預冷的0.2 cm電轉杯中，輕敲電轉杯，確?；旌衔镞M入電轉杯底部。設定電壓為7.5 kV/cm，電擊后迅速加入900 μL復蘇培養基，于37 ℃復蘇，取適量復蘇后菌液涂布于抗性平板上。37 ℃靜置培養2 d后菌落計數。

不同生長狀態時制備的感受態細胞，按上述方法與質粒pNZ44混合，進行電轉化。在電轉化效率最高的生長狀態下，分別對采取不同甘氨酸及蔗糖濃度的SGMRS所培養的感受態細胞進行電轉化。

選擇電轉效率最高的細胞狀態、以及相應的SGMRS培養基中甘氨酸和蔗糖濃度來制備感受態細胞。按照上述方法，分別在電壓7.5 kV/cm、10 kV/cm和12.5 kV/cm時將pNZ44質粒轉入感受態細胞。之后選擇轉化效率最高的電壓進行電轉化，分別復蘇1 h、2 h、3 h和4 h后涂布于抗性平板，計算電轉效率。

以上試驗均重復3次。按照下面的公式計算電轉化效率。

2 結果與分析

2.1 細胞培養狀態對電轉效率的影響

唾液乳桿菌(LactobacillussalivariusAR612)的生長曲線見圖1。培養狀態對電轉化效率的影響見圖2。唾液乳桿菌生長至OD600為0.1時，電轉效率最高，為6.29×107CFU/μg DNA。隨著OD600值升高，電轉效率逐漸降低。OD6000.3時，電轉化效率為2.33×105CFU/μg DNA，與OD6000.1相比，降低了2個數量級。

圖1 唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius AR612)的生長曲線

圖2 唾液乳桿菌培養狀態對電轉效率的影響

現有文獻報道的唾液乳桿菌感受態制備OD600通常為0.3～0.6[15-17]。洛雪等[18]制備嗜熱鏈球菌感受態細胞時，細菌生長至穩定期，即OD6000.8時電轉效率最高。在乳酸菌感受態制備的方法中，很少有使用生長至OD6000.1的細胞制備感受態。乳酸菌胞外多糖一般大量產生于穩定期[19]。LIU C T等[4]研究表明，唾液乳桿菌的胞外多糖產量在13株乳桿菌中最高，胞外多糖可能限制了外源分子進入細胞。本文研究的唾液乳桿菌生長至OD6000.1時，為對數生長初期，細胞壁結構疏松，胞外多糖產量較低，更利于外源分子轉入；細胞活力較高，經過電擊后也更容易存活[20]。

2.2 甘氨酸濃度對電轉效率的影響

革蘭氏陽性菌細胞壁的主要成分是肽聚糖。甘氨酸是細菌感受態制備最常用的細胞弱化劑，能取代細胞壁肽鏈上的L-丙氨酸和D-丙氨酸，影響N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸組成的雙糖單位、短肽鏈和肽橋組成的肽聚糖的結構，使細胞合成過程中形成較為松散的肽聚糖層，起到弱化細胞壁的作用，利于外源DNA的轉入[21,22]。但過高的甘氨酸濃度會抑制細菌生長[23]。

甘氨酸濃度對唾液乳桿菌電轉化效率的影響見圖3。當甘氨酸濃度從0增加到5 g/L，電轉效率略有降低，這可能是因為甘氨酸濃度增高對菌株生長造成抑制。當甘氨酸濃度增加到10 g/L，電轉效率最高，達到6.74×107CFU/μg DNA，此時甘氨酸對電轉效率的增強作用超過了對細菌生長的抑制作用。隨著甘氨酸濃度繼續增加，電轉化效率降低。

圖3 甘氨酸濃度對電轉效率的影響

2.3 蔗糖濃度對電轉效率的影響

蔗糖是滲透穩定劑，電轉培養基中加入蔗糖可顯著提高轉化效率[24]。研究表明，這可能是因為蔗糖存在緩解了甘氨酸引起的細胞裂解[25]。蔗糖濃度對電轉化效率的影響見圖4。隨著蔗糖濃度增加，電轉化效率呈現先增加后降低的趨勢。當蔗糖濃度為0.3 mol/L時，電轉效率最高，為1.59×108CFU/μg DNA。

圖4 蔗糖對電轉效率的影響

2.4 電壓對電轉效率的影響

電轉化是在電壓的作用下，使細胞膜上的電荷分離，產生高強度的跨膜電位差，電位差超過臨界水平時，細胞膜表面形成暫時的孔道，外源分子得以進入細胞內部[20]。電壓過低，細胞膜上難以形成足夠大小的孔洞，外源分子難以轉入；提高電壓，細胞膜上產生的孔洞增多，細胞膜通透性增強，外源分子更易進入細胞；但電壓過大超過細胞承受能力時，會導致細胞死亡[26]。

電壓對電轉化效率的影響見圖5。當電壓在7.5至10 kV/cm范圍時，可獲得較高的電轉化效率(2.11～2.12×107CFU/μg DNA)。由于考慮到電壓提高會對細胞造成損傷，因此選擇電壓為7.5kV/cm-1進行下一步實驗。

圖5 電壓對電轉效率的影響

2.5 復蘇時間對電轉效率的影響

感受態細胞電擊后，在不含抗生素的復蘇培養基中培養一段時間，有利于細胞恢復活性[27]。若復蘇時間較短，細胞膜上由于電擊產生的孔洞來不及閉合，影響細胞正常生長；復蘇時間過長，缺少抗性選擇壓力，容易造成質粒丟失[28]。復蘇時間對電轉化效率的影響見圖6。隨著復蘇時間增加，電轉化效率逐漸增大，3 h后電轉效率的增長幅度趨于平緩。為節省實驗時間，選擇復蘇時間為3 h。

圖6 復蘇時間對電轉效率的影響

3 總結與討論

唾液乳桿菌作為可食用益生菌，對人體健康具有重要意義。由于其細胞壁的結構特點，尚無高效的外源基因導入方法，制約了該菌株在功能基因、益生機制等方面的基礎研究。采用電轉化方法，可以較高轉化效率使外源DNA穩定的轉入唾液乳桿菌細胞中，這是對其進行遺傳操作的基礎。

影響乳酸菌電轉化效率的因素比較復雜，如菌體的培養狀態、培養基成分、緩沖液成分、電壓、復蘇時間、質粒濃度等。本文優化了一株唾液乳桿菌L.salivariusAR612的電轉化參數，確保外源質粒能高效轉入細胞，滿足了后續遺傳操作的需要。試驗確定唾液乳桿菌的最佳電轉化參數為：OD6000.1，甘氨酸濃度10 g/L，蔗糖濃度0.3 mol/L，電壓7.5kV/cm，復蘇時間3 h。在該條件下，唾液乳桿菌AR612的電轉化效率最高可達1.16×108CFU/μg DNA。與優化前相比，轉化效率提高了3個數量級。其中細菌生長狀態和電壓對電轉化效率的影響遠大于甘氨酸濃度、蔗糖濃度和復蘇時間。據文獻中已報道的唾液乳桿菌電轉化效率，最高為103～105CFU/μg DNA[29]，本文優化后的方法在效率上更具優勢。

質粒濃度也會影響乳酸菌電轉化效率。在一定濃度范圍內，電轉化效率隨質粒濃度提高而提高，超過一定范圍后，轉化效率出現不同程度的降低[23,30-32]。但本研究所用唾液乳桿菌AR612，質粒濃度從10 ng增加至1 μg，轉化效率未見差異。前人研究結果也顯示，質粒濃度在一定范圍內，質粒濃度對電轉化效率影響不大[33,34]，這與本文的發現一致。

乳酸菌具有較強的菌株特異性，不同乳酸菌的最佳電轉化方法存在差異。將本文優化所得參數用于實驗室保藏的另一株唾液乳桿菌AR809，電轉化效率可提高至102～103CFU/μg DNA，但與本研究所用的唾液乳桿菌AR612相比，轉化效率存在明顯差異。唾液乳桿菌AR809的胞外多糖產量高于AR612，這可能是限制AR809轉化效率的主要原因之一。通過比較基因組雜交方法證明唾液乳桿菌具有較高的基因多樣性。與對照基因組相比，高達23.6%的基因是可變的[35]。此外，研究還顯示某些乳酸菌中存在限制性修飾機制，該機制相當于原核生物的免疫系統，可抵御外源DNA進入細菌內部，從而降低了電轉化效率[36]。另有研究者發現，當質粒直接轉入植物乳桿菌時，無法穩定獲得轉化子，但通過植物乳桿菌的無細胞提取物對質粒DNA進行體外修飾后，可成功繞過限制性修飾機制，將轉化效率提高至5.8×105CFU/μg DNA[37]。綜上所述，乳酸菌的電轉化仍需具體問題具體分析，針對特定菌株找出最有效的轉化方法。