化妝品中苯氧乙醇和辛酰羥肟酸含量的測定方法

朱禮坪，黃澤彬，李 東，黃小茉,3*，謝小保,3

1.廣東迪美生物技術(shù)有限公司，廣東廣州 510663；2.廣東省防霉抗菌工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510070；3.廣東省微生物研究所省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室，廣東廣州 510070

苯氧乙醇從20世紀(jì)80年代中期開始廣泛應(yīng)用于化妝品配方中，是一種高沸點、低揮發(fā)性溶劑，還是一種高效、低致敏、廣譜的殺菌防腐劑。苯氧乙醇與常見化妝品防腐劑或抗氧劑復(fù)配使用可有效地抑制或殺滅銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母菌、黑曲霉和大腸桿菌等[1]。羥肟酸類化合物是一種對金屬離子具有高效選擇性的螯合劑，而辛酰羥肟酸在化妝品中可與原料或水中有害的金屬離子絡(luò)合，能抑制這些金屬離子的活性，防止對產(chǎn)品或原料造成渾濁、氧化、變色等不良影響，有利于延長化妝品原料或成品的保質(zhì)期[2]。近年來，由于辛酰羥肟酸在眾多國家中安全性及其在全球化妝品法規(guī)管理中除澳大利亞NICNAS專門對辛酰羥肟酸在最大使用濃度不超過0.3%的情況外，其他國家對它的使用并無使用限制說明[3-5]。專利號CN102920612A[6]報道，苯氧乙醇與辛酰羥肟酸復(fù)配時更可達(dá)廣譜抑菌殺菌效果。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范[S]北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2015年第4版》中苯氧乙醇的含量測定方法為：流動相：0.05 mol/L磷酸二氫鈉+甲醇+乙腈(50+35+15)，加氯化十六烷三甲胺至最終濃度為0.002 mol/L，并用磷酸調(diào)pH至3.5，該方法需要用到緩沖鹽使其操作復(fù)雜、損耗色譜柱使色譜柱壽命降低且檢測耗時長。現(xiàn)如今對于辛酰羥肟酸的檢測方法中，廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院莫庭源等研究報道的方法為：甲醇+0.1%甲酸水溶液(55+45體積比)，該方法需要使用緩沖鹽同理不推薦[7]。還有廣州立白企業(yè)集團(tuán)有限公司、廣州芭薇生物科技有限公司對化妝品中辛酰羥肟酸含量進(jìn)行了分析，方法中分別以乙腈∶水=55∶45(體積比)、乙腈∶水=45∶55(體積比)進(jìn)行檢測分析[8、9]。經(jīng)驗證，該方法在化妝品中辛酰羥肟酸出峰時間會與苯氧乙醇出峰時間完全一致或有重疊峰而造成干擾，會影響目標(biāo)物質(zhì)的定性和定量。因此，開發(fā)不使用緩沖鹽，可以減少其對色譜柱的損耗且檢測效率提高，并使化妝品中辛酰羥肟酸和苯氧乙醇峰型分離度高，簡單可靠，線性范圍寬，抗干擾能力強(qiáng)，具有良好的精確度和精密度的檢測方法具有重要市場應(yīng)用價值。

本方法選用甲醇/乙腈/水為流動相，擬建立起同時精確檢測化妝品中苯氧乙醇和辛酰羥肟酸的含量，并對其線性范圍、精確度、回收率和兩種成分的抑菌防腐性能作分析研究。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

儀器：HPLC-20A高效液相色譜儀、SPD-M20A 230V型光電二極管陣列可見光檢測器(日本島津公司)；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);XW-80A旋渦混合器(上海淇特分析儀器有限公司)；TG16-WS臺式高速離心機(jī)(湖南湘實驗室儀器開發(fā)有限公司)；超純水機(jī)；ME204E/02型萬分之一電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

試劑：乙腈、甲醇，色譜純，上海安譜廣州分公司；苯氧乙醇、辛酰羥肟酸原料(市售)。

1.2 儀器工作條件

島津InertSustain C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫40 ℃；流動相∶甲醇∶乙腈∶水=35∶15∶50，流速：1 ml/min；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長230 nm；柱溫：40 ℃。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別準(zhǔn)確稱量取苯氧乙醇、辛酰羥肟酸，用甲醇溶解，定容到100 mL容量瓶。配置成濃度為1.0×10-3mol/L的儲備液，放置于4 ℃冰箱中保存。將苯氧乙醇和辛酰羥肟酸儲備液用HPLC級甲醇稀釋，并配制成含有苯氧乙醇和辛酰羥肟酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液。苯氧乙醇濃度分別為1.0×10-5mol/L、5.0×10-5mol/L、1.0×10-4mol/L、5.0×10-4mol/L和1.0×10-3mol/L;辛酰羥肟酸濃度分別為5.0×10-5mol/L、1.0×10-4mol/L、5.0×10-4mol/L、1.0×10-3mol/L和5.0×10-2mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 提取

水樣、面膜液、護(hù)理液、膏霜試驗:稱取0.5 g(精確到0.001 g)試驗置于15 mL尖底離心管中，用甲醇定容至10 mL，于旋渦振蕩器上振蕩均勻后，超聲提取40 min,繼續(xù)旋渦振蕩器上振蕩均勻后于離心機(jī)以10 000 r/min離心10 min。上機(jī)分析前使用0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾，濾液作為待測樣液備用。

1.5 樣品微生物防腐性能實驗測試

分別在面膜液、護(hù)理液、膏霜三種化妝品中添加1 000 mg/kg苯氧乙醇和500 mg/kg辛酰羥肟酸，然后按廣東省日化商會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/GDDC 010-2019《化妝品防腐挑戰(zhàn)測試方法》測試產(chǎn)品的防腐功效。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

苯氧乙醇和辛酰羥肟酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1，由圖可見，苯氧乙醇的峰保留時間于5.0 min左右，而辛酰羥肟酸的峰保留時間于6.3 min左右，兩原料的出峰時間相差較大，無出現(xiàn)重疊干擾。

圖1 苯氧乙醇和辛酰羥肟酸的色譜圖

2.2 檢測波長與方式選擇

取配置好的苯氧乙醇和辛酰羥肟酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在190 nm～500 nm檢測波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，測定苯氧乙醇和辛酰羥肟酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外-可見吸收光譜(如圖2和圖3所示)，苯氧乙醇、辛酰羥肟酸分別在215 nm、200 nm附近有強(qiáng)吸收峰，經(jīng)多次實驗分析采用210 nm可以獲得較高靈敏度，干擾較少。因此選擇檢測波長為210 nm。

圖2 苯氧乙醇光譜圖

圖3 辛酰羥肟酸光譜圖

2.3 流動相選擇

分別考察了甲醇/水、乙腈/水、甲醇/乙腈/水溶液等多種流動相中苯氧乙醇和辛酰羥肟酸的分離情況。結(jié)果表明，采用甲醇/水為流動相，只有苯氧乙醇出峰；選擇乙腈/水溶液為流動相時，其體積比不同分離度差別較大，在乙腈流動相大于50%時，苯氧乙醇和辛酰羥肟酸峰型完全重疊，小于50%時，分離度會高一點，但是有重疊峰造成干擾,因此,乙腈/水流動相影響目標(biāo)物質(zhì)的定性和定量；使用甲醇/乙腈/水的流動相，目標(biāo)物質(zhì)分離效果好且獲得最佳UV響應(yīng)，最佳分離條件為甲醇∶乙腈∶水=35∶15∶50等梯度洗脫。

2.4 檢出限與定量限

取一定濃度的混合對照品溶液用液相色譜儀進(jìn)行測試，記錄色譜圖，根據(jù)其峰信號，將信噪比為3∶1時的進(jìn)樣量為檢出限，測得苯氧乙醇的檢出限為5 mg/L、辛酰羥肟酸的檢出限為10 mg/L。信噪比為10∶1時的進(jìn)樣量為檢出限，測得苯氧乙醇的定量限為15 mg/L、辛酰羥肟酸的檢出限為50 mg/L。

2.5 線性范圍考察

各梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后按“1.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析,每個濃度進(jìn)樣3次,取3次平均值,所得色譜峰對應(yīng)的濃度和對應(yīng)的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程,如表1所示。結(jié)果表明,苯氧乙醇和辛酰羥肟酸線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0。

表1 苯氧乙醇和辛酰羥肟酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

2.6 重復(fù)性試驗

精密稱取面膜液、膏霜樣品各6份，每份約0.5g，按“1.4.1”項下操作,照“2.1”色譜條件下進(jìn)樣分析,記錄峰面積并計算含量,結(jié)果面膜液和膏霜中苯氧乙醇和辛酰羥肟酸平均含量分別為0.1%,0.05%，RSD分別為0.23%，0.48%(n=6)，結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

分別將待測樣品溶液在室溫下放置，分別在白天、夜間和第二天白天按照“2.1”色譜條件下進(jìn)樣分析,記錄峰面積并計算含量,計算RSD。結(jié)果顯示,RSD均小于0.05%(n=6),表明兩種防腐劑在室溫下放置24 h的穩(wěn)定性好。

2.8 回收率和精密度試驗

取液態(tài)水基、面膜液、護(hù)理液類、膏霜類4種空白基質(zhì)為加標(biāo)基質(zhì)，按“2.1”色譜條件下進(jìn)行低、中、高3個加標(biāo)水平的回收率試驗，結(jié)果顯示，苯氧乙醇的3個加標(biāo)水平回收率為97.2%～104.4%,辛酰羥肟酸的3個加標(biāo)水平回收率為98.2%～104.5%(n=6),表明本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可滿足苯氧乙醇和辛酰羥肟酸含量測定的要求(見表2)。

表2 辛酰羥肟酸、苯氧乙醇的回收率和精密度(n=6)測定結(jié)果

2.9 實際樣品檢測

隨機(jī)抽取市售的水劑類、乳液類、膏霜類化妝品各10份,應(yīng)用本文建立的方法進(jìn)行檢測，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算含量，結(jié)果顯示，部分苯氧乙醇添加量為0.1%～0.3%，辛酰羥肟酸添加量為0.03%～0.08%。選取乳液類化妝品樣品色譜圖如圖4。

圖4 乳液類化妝品樣品色譜圖

2.10 樣品的抑菌防腐性能分析

含1 000 mg/kg苯氧乙醇和500 mg/kg辛酰羥肟酸的面膜液、護(hù)理液、膏霜對微生物防腐挑戰(zhàn)實驗測試結(jié)果如圖5所示，在106CFU/g～107CFU/g高濃度菌種中加入樣品7 d內(nèi)，其菌落總數(shù)均降低至<10 CFU/g，而通過測試辛酰羥肟酸的最低抑菌濃度(MIC)，單獨辛酰羥肟酸對各常見菌種最低抑菌濃度均于800 mg/kg ～1 000 mg/kg，在化妝品中做防腐使用成本較高，而單使用苯氧乙醇作防腐劑不僅添加量大，且氣味大，因此，苯氧乙醇和辛酰羥肟酸復(fù)配作化妝品防腐劑是具有較高性價比、滿足市場需求的實用方案，而本文研究的檢測方法可以精確、快速同時檢測苯氧乙醇和辛酰羥肟酸的含量，且避免兩成分在檢測中相互干擾，為市場化妝品中防腐劑成分含量檢測起重要作用。

圖5 面膜液、護(hù)理液、膏霜樣品微生物防腐挑戰(zhàn)測試結(jié)果

3 結(jié)論

本文通過研究流動相組成對兩種原料原料色譜保留性能的影響，克服峰重疊干擾問題，采用甲醇-乙腈-水溶液為流動相，反相液相色譜法檢測化妝品中的苯氧乙醇和辛酰羥肟酸的含量，檢測下限分別為5mg/L和20 mg/L。方法的回收率為97.2%～104.5%，RSD為1.5%～4.1%，說明該方法色譜峰分離度高且對稱，檢測方便快捷，結(jié)果精密度高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點。此外，本文提供化妝品中苯氧乙醇和辛酰羥肟酸復(fù)配的抑菌防腐性能活性含量分析結(jié)果，為滿足市場需求的使用提供參考方案。