河南部分地區番茄黃化曲葉病毒和番茄褪綠病毒復合侵染的分子鑒定

王東 劉帥 張燕 楊世瑋 蘇玉靜 陳紅旭 丁飛 薛東齊 賈芝琪

摘? ? 要：為調查河南省部分地區番茄病毒病危害情況，于2019年10月采集16份表現黃化、曲葉癥狀的番茄植株，利用分子生物學技術對其進行鑒定。結果表明：供試樣品均被TYLCV（Tomato yellow leaf curl virus）侵染，31.75%的樣品被TYLCV和ToCV（Tomato chlorosis virus）復合侵染;DNA全序列比對分析發現，供試樣品中分離的TYLCV河南菌株與TYLCV-Is等地區的核苷酸序列同源性均達到94%以上，其中TYLCV-HN-AY-1分離物與TYLCV-Almeria（NC004005.1）序列相似性最高，為99.5%;對供試樣品TYLCV抗病基因分子檢測發現，部分番茄樣品含有Ty-1、Ty-2、Ty-3/Ty-3a，表明部分TYLCV株系已突破Ty-1、Ty-2、Ty-3/Ty-3a的抗性。該結果對指導河南省番茄的安全生產具有重要意義。

關鍵詞：番茄;黃化曲葉病毒;番茄褪綠病毒;復合侵染

中圖分類號：S641.2+S436.412.1+1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）02-012-006

Molecular identification of Tomato yellow leaf curl virus and Tomato chlorosis virus in some areas of Henan province

WANG Dong， LIU Shuai ， ZHANG Yan， YANG Shiwei， SU Yujing， CHEN Hongxu， DING Fei， XUE Dongqi， JIA ZhiqiA

（College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to investigate the damage of tomato virus disease in some areas of Henan province， 16 tomato samples with symptoms of yellow leaf curl were collected in October 2019 and identified by molecular biology techniques.Results showed that the samples were all infected by TYLCV（tomato yellow leaf curl virus）， and 31.75% of the samples were infected by TYLCV and ToCV（tomato chlorosis virus）. DNA sequence alignment analysis showed that the nucleotide sequence homology between the Henan isolates and other regions reached over 94%. The sequence identity between TYLCV-HN-AY-1 and TYLCV-Almeria （NC004005.1） isolation is 99.5%. The detection of TYLCV resistance genes found that some tomato samples contained TYLCV resistance genes Ty-1， Ty-2 and Ty-3/Ty-3a， indicating that TYLCV Henan strains have broken the resistance of Ty-1， Ty-2 and Ty-3/Ty-3a. The results are of great significance to guide the safe production of tomato in Henan Province.

Key words： Tomato; Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）; Tomato chlorosis virus（ToCV）; Mixed infections

番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）屬于雙生病毒科（Geminiviridiae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）。該病毒由煙粉虱傳播，發病迅速，嚴重危害番茄生產，甚至導致番茄絕產[1]。番茄感病植株表現為植株生長發育緩慢、矮化，節間明顯變短，葉片變厚、變小，葉片邊緣至葉脈區域黃化，葉緣向上卷曲，果實坐果數量明顯減少，且易出現變小和畸形[2]。TYLCV首次在以色列被發現，然后隨著媒介煙粉虱的傳播在全球范圍內大暴發，我國在2006年首次在上海檢測到TYLCV后，北京、河北、河南、浙江等20個省市的番茄產區陸續檢測到該病毒，給番茄生產帶來巨大影響，造成嚴重的經濟損失[1，3-5]。番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）是由煙粉虱傳播的單鏈RNA病毒，屬于長線型病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus），番茄感病植株主要表現為葉片褪綠和黃化癥狀，在番茄生產上常被誤認為缺素癥，導致診斷和防治的延誤。番茄褪綠病毒于1998年首次在美國佛羅里達州被發現，之后在意大利、巴西、以色列等國也相繼被報道[6-8]。番茄褪綠病毒在2004年傳播到我國臺灣，隨后在江蘇、北京、南京、河南、河北、天津、湖南等設施番茄產區陸續有該病毒的報道，并且造成嚴重損失[9-11]。

TYLCV和ToCV的單獨侵染或復合侵染均能夠對番茄造成嚴重損失，因此對病害的檢測和防治就顯得尤為必要。目前在ToCV和TYLCV的檢測方法上主要有目測法、分子生物學方法、組織印跡雜交法、血清學檢測技術等[10，12-16]。分子生物學方法通過檢測病毒核酸來檢測病毒的存在，其特異性更強，檢測病毒的范圍更廣，并可以進行大批量樣本檢測。在TYLCV抗病基因挖掘方面，現已發現的TYLCV抗病基因有Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4、Ty-5、Ty-6;在抗病品種選育方面，我國育成的一系列抗TYLCV番茄品種中大多數含有Ty-1，少數含有Ty-2或Ty-3抗病基因[16]。ToCV雖然發現較早，但是番茄抗ToCV的種質資源篩選和育種進展則相對緩慢，目前國內外尚未有抗ToCV的番茄品種的報道。越來越多的田間觀察結果發現，很多含有Ty抗病基因的番茄品種和材料表現感病，推測原因可能是病毒菌株發生變異，或是其他病毒的復合侵染降低了抗病基因的抗病性[17-18]。

本研究于2019年10月在河南省部分番茄產區收集出現葉脈褪綠、心葉黃化、曲葉等癥狀的番茄樣品，對其進行了病原物分析、測序鑒定和序列分析，并分析了ToCV與TYLCV復合侵染的情況，對樣品攜帶的抗病基因進行了分子標記鑒定。該結果對探究番茄黃化曲葉病毒抗病基因抗病性喪失原因及指導河南省番茄的安全生產具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

16份表現黃化、曲葉癥狀的番茄樣品于2019年10月采自河南省番茄主要產區，具體信息見表1。

1.2 番茄黃化曲葉病毒分子鑒定

番茄樣品總DNA提取采用CTAB法，利用TYLCV特異性引物（表2）進行PCR擴增，PCR體系：2X San Taq PCR Mix 12.5 ?L，上下游引物各1.5 ?L，模板DNA 1 ?L，ddH2O 8.5 ?L。PCR程序為95 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃延伸3 min，35次循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物純化回收送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 番茄褪綠病毒分子鑒定

番茄樣品采用北京華越洋植物多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取RNA，反轉錄采用莫納反轉錄試劑盒，反轉錄體系：RNA 1 ?L，MonScriptTM 5×RTIII AII-in-One Mix 4 ?L，MonScriptTM dsDNase 1 ?L，Nuclease-Free Water 14 ?L。反轉錄程序：37 ℃ 2 min，55 ℃15 min，85 ℃ 5 min。反轉錄完成后的cDNA于-80 ℃保存。采用ToCV特異性引物ToCV-F/R（表2）進行PCR擴增，PCR體系：2× San Taq PCR Mix 12.5 ?L，上下游引物各1.5 ?L，cDNA第一鏈1 ?L，ddH2O 8.5 ?L。PCR程序為94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，57 ℃30 s，72 ℃延伸30 s，35次循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 TYLCV抗病基因Ty-1、Ty-2、Ty-3的PCR分子檢測

利用Ty-1、Ty-2、Ty-3抗性基因分子標記引物（表2）進行PCR擴增，PCR體系：2× San Taq PCR Mix 12.5 ?L，上下游引物各1.5 ?L，模板DNA 1 ?L，ddH2O 8.5 ?L。PCR程序為94 ℃預變性3 min，隨后94 ℃變性30 s，57.5 ℃ 30 s，72 ℃延伸45 s，35次循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物經1%（w）的瓊脂糖凝膠檢測或7%（w）的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 番茄TYLCV的鑒定

16份番茄樣品經TYLCV特異引物擴增，全部樣品均檢測出2 800 bp左右的目的條帶（表3，圖1-a），PCR產物測序結果證實為TYLCV病毒，感染率為100%;測序獲得的番茄TYLCV河南分離物的全長為2 781 bp。從NCBI中選取各地區TYLCV分離物，其中包括國內分離物20個，國外分離物6個，與本次分離得到TYLCV分離物進行比較，結果表明，該基因的核苷酸序列與TYLCV-Is（X15656.1）、TYLCV-Almeria（NC004005.1）、TYLCV- California（EF539831.1）、TYLCV-Florida-3.1 （KY971328.1）、TYLCV-JSNJ1（FN256259.1）、TYLCV-SH3（FN256258.1）、TYLCV-ZJ3（AM698117.1）、TYLCV-HBWH（MF590732.1）、TYLCV-BJ03（KT338293.1）、TYLCV-XX （JQ004048.1、MF668139.1、MF668140.1、MF668141.1）、TYLCV-AY（JQ034613.1、KX034539.1）、TYLCV-JZ（KX034541.1、KX034542.1、KX034546.1）、TYLCV-ZZ（MF590734.1）等分離物的相似性均在94%以上，其中TYLCV-Almeria（NC004005.1）分離物與TYLCV-HN-AY-1序列相似性最高，為99.5%，TYLCV-HN-XX-6與TYLCV-AY（JQ034613.1）序列相似性最低，為94.82%。

系統進化樹分析表明（圖2），所選擇的序列共分為幾大分支，其中此次分離到的TYLCV河南分離物與來自中國廣東、廣西、云南大理和以色列、泰國等國家或地區的TYLCV分離物聚在一個大分支，與TYLCV-XX（MF668139.1、MF668141.1）、TYLCV-JZ（KX034541.1、KX034542.1、KX034546.1）、TYLCV-AY（KX034539.1）、TYLCV-ZZ（MF590734.1）等分離物親緣關系相對較近，與TYLCV-California（EF539831.1）、TYLCV-JSNJ1（FN256259.1）、TYLCV-XX（JQ004048.1）分離物親緣關系相對較遠，與TYLCV-BJ03（KT338293.1）、TYLCV-HBWH（MF590732.1）、TYLCV-SH3（FN256258.1）、TYLCV-ZJ3（AM698117.1）4個分離物的親緣關系最遠。

2.2 番茄ToCV的鑒定

16份番茄樣品經ToCV特異性引物檢測并測序驗證，有5株番茄樣品檢測出239 bp的ToCV目的條帶（表3，圖1-b），其中新鄉、安陽和長葛地區分別有2個、2個和1個樣品檢測到ToCV。這5株番茄樣品為TYLCV和ToCV復合侵染，復合侵染率31.75%，新鄭地區番茄樣品沒有檢測到ToCV。

2.3 番茄TYLCV抗病基因分子標記分析

對16份番茄樣品進行Ty-1基因檢測，發現所有樣品均檢測到252 bp（Ty-1，抗病條帶）和264 bp（ty-1，感病條帶）的特異性條帶（表3，圖1-c）;其中Ty-1/Ty-1純合基因型番茄樣品3份、Ty-1/ty-1雜合基因型番茄樣品7份、ty-1/ty-1感病基因型番茄樣品6份。對Ty-2基因的檢測發現，所有樣品均檢測到295 bp（Ty-2，抗病條帶）和619 bp（ty-2，感病條帶）的特異性條帶（表3，圖1-d）;其中Ty-2/Ty-2基因型番茄樣品2份、Ty-2/ty-2基因型番茄樣品3份、ty-2/ty-2基因型番茄樣品11份。對Ty-3基因的檢測發現，所有樣品均檢測到630 bp（Ty-3a，抗病條帶）、450 bp（Ty-3，抗病條帶）或320 bp（ty-3，感病條帶）的特異性條帶（表3，圖1-e）;其中Ty-3a的純合基因型番茄樣品1份、Ty-3a的雜合基因型番茄樣品6份、不含Ty-3基因的番茄樣品6份、Ty-3純合基因型番茄樣品1份、Ty-3雜合基因型番茄樣品1份、同時含有Ty-3和Ty-3a基因型番茄樣品1份。

3 討論和結論

趙黎明等[24]首次在山東發現TYLCV和ToCV的復合侵染，隨后吳淑華等[25]在江蘇再次發現TYLCV和ToCV的復合侵染。在此期間TYLCV和ToCV的復合侵染已從我國華南地區擴散到全國各地，造成這種現象的原因可能與農藝生產活動相關聯[24-26]。但ToCV的侵染會不會造成寄主植株對TYLCV抗性的減弱值得進一步研究。

本研究樣品TYLCV分離物測序結果經NCBI比對驗證為TYLCV。本研究結果與之前河南地區報道的TYLCV-XX（JQ004048.1、MF668139.1、MF668140.1、MF668141.1）、TYLCV-JZ（KX034541.1、KX034542.1、KX034546.1）、TYLCV-AY（JQ034613.1、KX034539.1）、TYLCV-ZZ（MF590734.1）均與TYLCV-Is（X15656.1）進行兩兩序列比對，結果發現序列相似性均在94%以上，依據雙生病毒分類標準，同種雙生病毒基因組序列同源性大于 94% 被認為是同一株系的不同變種，判斷這6個分離物屬于TYLCV-Is株系[27]，研究結果表明TYLCV在河南并沒有發生新的病毒菌株。

對河南16份番茄樣品Ty抗病基因的檢測發現，被TYLCV侵染的HN-XX-4、HN-XX-5番茄樣品中同時含有Ty-1、Ty-2、Ty-3/Ty-3a抗性基因（表3），表明TYLCV已經突破Ty-1、Ty-2、Ty3/Ty3a的抗性。但抗病基因抗病性喪失的原因有待進一步研究，可能的原因是隨著病毒長時間的傳播以及含有Ty-1、Ty-2、Ty3/Ty3a抗病品種的廣泛種植，而造成變異菌株的流行，但具體是哪些位點突變所引起的還有待進一步實驗證實。本研究中含有Ty-1、Ty-2、Ty-3抗性基因的部分樣品具有感病癥狀并檢測到TYLCV，卻并未檢測到ToCV，暗示了TYLCV和ToCV的復合侵染不是抗病性降低的主要原因。田兆豐等[17]為了解不同抗病品種中番茄黃化曲葉病毒基因變異的情況，對感染 TYLCV 的番茄抗病品種進行了TYLCV全長基因克隆和測序，未發現新的病毒菌株，推測是原有菌株的變異引起抗病基因的抗病性喪失，與本研究結果一致。Torre等[28]在含有Ty-1基因的番茄抗性品種上接種TYLCV病毒18 d后，將其與對照相比觀察到輕微的花葉癥狀，表明不同抗病基因型對TYLCV抗性水平不同，接種壓力、株齡、溫度和光照強度均可能對疾病癥狀產生非常重要的影響[29]。但環境因素是否會影響抗病基因的抗病性也待更進一步的研究。

本研究為了解河南省部分番茄產區TYLCV和ToCV的分布、序列變異、進化等情況提供了研究基礎，同時該研究結果對探究番茄黃化曲葉病毒抗病基因抗病性喪失原因以及指導河南省番茄品種選擇和安全生產都具有重要意義。

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