過氧化物氧化還原酶6調控肉品嫩度的研究進展

王新怡，張一敏，梁榮蓉，董鵬程，羅 欣，毛衍偉

（山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018）

嫩度是反映牛肉食用品質的關鍵指標，影響消費者對產品的接受程度[1]。多項研究表明，消費者愿意以更高的價格來購買嫩度更好的牛排[2]。隨著蛋白質組學技術在肉品品質的研究成果越來越多，科研人員發現并提出有些蛋白分子可作為肉品品質的分子標記。Shen Jin等[3]使用蛋白質組分析電刺激影響嫩度的機制時發現，電刺激提高了肉的嫩度，一方面電刺激影響pH值-溫度窗口、加速骨架蛋白降解外；另一方面，電刺激還會導致過氧化物氧化還原酶6（peroxiredoxin 6，Prdx6）的表達發生變化；Yang Xiaoyin等[4]在研究牛肉的氣調包裝時發現，氣調包裝會影響牛肉嫩度，也會影響Prdx6的表達。此外，Liu Yang等[5]對Prdx6的基因多態性與肉的品質性狀關系進行分析，提出Prdx6的基因多態性是牛肉嫩度的標記物。Jia等[6]的研究表明Prdx6的表達量與嫩度呈正相關，嫩度高的肉可能發生了較低的氧化應激。

目前，諸多報道集中在對Prdx6活性和生理作用的研究上，也有研究發現Prdx6與嫩度有關。但目前并未檢索到對Prdx6影響嫩度通路的系統總結。為了明確Prdx6對肉嫩度的影響機制，本文首先剖析了Prdx6的結構與活性、動物屠宰后氧化應激的產生以及Prdx6消除氧化物的機制，并以Prdx6的氧化還原酶活性、磷脂氫過氧化物谷胱甘肽過氧化物酶（phospholipid hydroperoxide GSH peroxidase，PHGPx）活性、磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）活性和溶血磷脂酰基轉移酶（lysophosphatidylcholine acyl transferase，LPCAT）活性為基礎，總結了Prdx6通過調控蛋白質與脂質氧化、細胞凋亡、小熱休克蛋白（small heat shock proteins，sHSPs）、細胞自噬以及還原過氧化膜磷脂影響肉品嫩度的機制。以期完善闡明肉的嫩化機制，指出肉品品質研究的新方向，并為開發調控肉品嫩度的技術提供理論指導。

1 Prdx家族及Prdx6的結構與活性

Prdx是一類非硒依賴過氧化物酶家族，共有6 個成員，可以還原過氧化氫和烷基氫過氧化物[7]。Prdx1～5均含有兩個Cys殘基，而Prdx6僅含有一個Cys殘基[8]。如圖1所示，該Cys在N端第47位是過氧化物酶活性的電子轉移位點，位于Prdx6結構表面的“口袋”狀凹槽中；Prdx6的過氧化物酶活性區間在蛋白質晶體結構的Cys47-His39-Arg132處。與Prdx1～5不同，Prdx6還有非鈣依賴性的PLA2活性[9]，Ser32位點是PLA2的活性位點，對應的蛋白結構是Ser32-His26-Asp140，PLA2活性在控制哺乳動物細胞氧化還原狀態和維持細胞膜的磷脂代謝中起關鍵作用，參與細胞內或細胞間的信號傳導，促進細胞再生和增殖，并防止細胞凋亡[10-11]。

圖1 Prdx6結構示意圖[10]Fig.1 Structure diagram of Prdx6[10]

2 Prdx6通過氧化還原酶活性影響肉品嫩度

動物屠宰后，環境變化使細胞產生應激，胞內活性自由基含量上升，破壞了原有的氧化還原平衡，使細胞內蛋白質和脂質發生氧化，細胞受到損害并觸發凋亡[12]。細胞為了對抗損害會激活熱休克因子并合成sHSPs。sHSPs通過抑制μ-鈣蛋白酶（μ-calpain）對細胞骨架蛋白的降解，延遲細胞凋亡進程影響肉的嫩度[12]。Prdx6具有氧化還原酶活性，可通過清除活性自由基、調控蛋白質與脂質氧化、調控細胞凋亡通路以及調控sHSPs的表達最終影響肉的嫩度。

2.1 動物屠宰后氧化應激的產生

生物體內的許多反應如金屬或酶催化的氧化反應或生物過程都會產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS分為自由基（O2－·、·OH等）和非自由基衍生物（H2O2等）[13]。線粒體電子傳遞鏈（mitochondrial electron transport chain，mETC）攜帶的電子通過電子漏傳遞給氧，形成O2－·[14]；O2－·可與陽離子生成·OH或在超氧化物歧化酶等的催化下產生H2O2；H2O2通過芬頓（Fenton）反應和哈伯-韋斯（Haber-Weiss）反應產生·OH，進而導致脂質過氧化、蛋白質氧化和DNA的損傷[15]。除線粒體外，內質網、胞質和細胞膜也會產生ROS[16]。在正常的生理狀態下，包括Prdx6在內的抗氧化防御酶系統和非酶系統會清除骨骼肌細胞呼吸作用產生的少量ROS，僅保留中低濃度的ROS作為信號分子參與細胞代謝調控[17]。動物屠宰后，肌肉（muscle）開始向肉（meat）轉化，骨骼肌細胞成為自由基最重要的來源，也是其主要的作用對象[18]；由于缺血缺氧環境的影響，mETC受到干擾，ROS生成量增加，激活細胞的防御反應；此時，若骨骼肌細胞的抗氧化防御系統不足以對抗ROS，則出現氧化應激[19-20]。骨骼肌細胞產生氧化應激后，原有的氧化還原體系被擾亂，細胞膜結構遭到破壞，細胞凋亡酶類被激活，sHSPs表達量上調[12]，蛋白質氧化和脂質氧化程度增加，最終影響肉的嫩度。通過對比應激與非應激肉品的差異蛋白點，發現差異蛋白主要參與氧化應激相應、免疫防御和凋亡3 個生物學過程[21]。

2.2 Prdx6消除氧化物的機制

Prdx6的反應底物包括H2O2、短鏈氫過氧化物（如叔丁基和異丙苯氫過氧化物）和過氧亞硝酸鹽（ONOO－）等。其反應位點為Prdx6單體上唯一的保守Cys（Prdx6氨基酸序列第47位）[22]。因此，Prdx6可利用其過氧化物酶活性清除細胞內的ROS，對維持胞內氧化還原穩態、對抗宰后應激具有十分重要的作用。

Prdx6還原底物需要與外源還原劑谷胱甘肽（glutathione，GSH）相互作用[23]。其反應機理如圖2所示：1）還原態的Prdx6單體（Prdx6—SH）在溶液中以反向平行的二聚體形式存在，疏水殘基L145、L148（分別表示位于Prdx6氨基酸序列第145、148位的亮氨酸）等維持界面穩定；2）清除胞內多余H2O2后，Prdx6被氧化成Prdx6—SOH，二聚體中的單體親和力降低；3）Prdx6與GSH的反應過程需要谷胱甘肽S轉移酶（π isoform of GSH-S-transferase，πGST）的催化[24,26]：在GSH存在的情況下，被氧化的Prdx6單體與πGST形成異二聚體后，GSH與Prdx6形成一個混合二硫鍵，將Prdx6谷胱甘肽化（Prdx6—SSG）[24,27]；4）Prdx6—SSG與GSH繼續反應，GSH被氧化成氧化型谷胱甘肽（GSSH），Prdx6回到最終的還原態（Prdx6—SH）[23]。

圖2 Prdx6消除氧化物的機制示意圖Fig.2 Mechanism for the peroxidase activity of Prdx6 in eliminating cellular reactive oxygen species

2.3 Prdx6影響肉品嫩度的機制

2.3.1 Prdx6調控蛋白質與脂質氧化

蛋白質氧化是指蛋白質在自由基及其相關氧化物的作用下，某些氨基酸殘基發生反應進而導致蛋白質結構與功能的變化。發生氧化后，蛋白質對氧化物的親和力增加，更易發生水解、聚合、交聯[28]。過量的ROS會通過抑制轉錄使蛋白質合成受阻、破壞蛋白質結構等途徑，使蛋白質降解或功能喪失[29]，造成骨骼肌細胞氧化損傷。如圖3所示，ROS介導蛋白氧化可直接攻擊其骨架蛋白主鏈和側鏈氨基酸殘基，導致蛋白質肽鏈骨架斷裂，加速蛋白降解，提高嫩度；也可以先介導脂質過氧化和非酶糖基化反應，隨后產生的中間產物在與蛋白發生反應，進而產生蛋白質羰基化產物和蛋白質交聯物[30]，影響骨架蛋白降解，導致嫩度下降。

圖3 Prdx6影響肉品嫩度的機制Fig.3 Mechanisms by which Prdx6 affects meat tenderness

在肌肉中，蛋白質的氧化會造成多肽的降解及ATP酶活性的降低，促使蛋白質與其他大分子物質交聯產生聚合物，影響肉的品質[31-32]。宰后成熟過程中，鈣蛋白酶（calpain）降解骨架蛋白對肉的嫩度有重要作用，而蛋白質氧化會使calpain失去活性，且氧化應激會改變肌球蛋白和肌動蛋白結構，降低其對蛋白水解酶的敏感性[33]，且/或導致肌原纖維蛋白結構的改變、發生交聯增強肌纖維結構[34]，導致肉的嫩度降低。

2.3.2 Prdx6調控細胞凋亡通路

細胞凋亡是機體為了維護自身穩定，由基因調控的細胞自主有序性死亡。細胞通過多種途徑發生凋亡，包括線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網途徑[35]。caspase家族幾乎介導了整個凋亡過程，是細胞凋亡進程中的關鍵酶[36]。其中，caspase-3是細胞凋亡的關鍵執行者。

線粒體途徑也被稱為內源途徑（圖3），線粒體通過MPTP將線粒體內外膜間隙的蛋白質，尤其是Cyt-c，釋放至細胞質中。Cyt-c與dATP介導的凋亡蛋白酶激活因子（apoptosis protease activating factor，Apaf）-1發生寡聚，導致Apaf-1構象改變，形成寡聚凋亡體。凋亡體聚集caspase-9前體并將其活化為caspase-9，激活caspase-3和caspase-7，最終激活凋亡級聯反應，在幾分鐘內即可導致細胞死亡。MPTP受到Bcl-2蛋白家族的調控，Bcl-2可抑制Cyt-c的釋放；Bax可刺激Cyt-c的釋放[37]；tBid可以傳遞信號以啟動凋亡[38]。

宰后骨骼肌細胞處于缺血缺氧狀態，骨骼肌產生的ROS含量增多，當細胞內Prdx6等抗氧化因子不足以清除過多的ROS時，會導致以下3 種結果：1）脂質過氧化增加，進而引起骨骼肌線粒體外膜通透性增加[39]；2）加速Bax/Bcl-2比值升高[40-41]，Bax激活后被轉移，插入線粒體外膜中，增大MPTP的開放程度，提高線粒體外膜透性[42]；3）胞外流入胞內的Ca2+及線粒體釋放的Ca2+濃度升高，進一步擴大MPTP的開放，導致線粒體膜電位的喪失[43]。以上結果均可促進Cyt-c被釋放至細胞質中，激活caspase-3，隨后激活細胞凋亡級聯反應、抑制鈣蛋白酶抑制蛋白（calpastatin）的降解。同時，線粒體中Cyt-c含量的顯著減少會導致mETC的進一步破壞，加劇ROS的產生。除Cyt-c之外，SMAC/Diablo（第二個線粒體衍生的半胱氨酸蛋白酶激活劑，second mitochondrial activator of caspase/direct IAP binding protein with low PI）和Omi/Htr A2（寡聚絲氨酸蛋白酶Htr A（high temperature requireement）家族中的一員）等也會通過線粒體外模移動至細胞質中，促進caspase活性[44]。因此，Prdx6可通過調控細胞凋亡內源性途徑的進程，抑制caspase-3的激活，進而抑制骨架蛋白的降解，對肉的嫩度造成影響。

死亡受體途徑也被稱為外源途徑（圖3）。細胞表面的死亡受體與細胞外對應的死亡配體結合后，結合或募集Fas相關的死亡域蛋白（Fas-associating protein with a novel death domain，FADD），FADD與caspase-8前體結合形成死亡誘導信號復合物（death-inducing signaling complex，DISC）并活化caspase-8[45-46]。Caspase-8可直接活化caspase-3執行凋亡；或裂解BID為tBID，從細胞凋亡外源性途徑轉為內源性途徑[47]。宰后成熟過程中，當細胞內Prdx6等抗氧化因子不足以清除過量的H2O2時，會導致：1）上游啟動因子p53的激活，加速啟動Fas受體介導的凋亡途徑[48]；2）Fas受體和Fas配體的mRNA和表達量上調[48-50]，加速激活caspase-8，進而從內源、外源兩條途徑加速caspase-3的活化。除此之外，過多的H2O2還會直接促進caspase-3和caspase-8的活化[48,51]。由此可見，Prdx6可通過調控細胞凋亡外源性途徑的進程，抑制caspase-3的激活，進而抑制骨架蛋白的降解，對肉的嫩度造成影響。

除此之外，Prdx6不足導致ROS過多時會產生內質網應激，Ca2+從內質網流出，激活calpain，同時激活caspase-12導致細胞凋亡[52]；長期的內質網應激導致脯氨酰4-羥化酶β亞基從內質網向線粒體釋放，引發細胞凋亡[53]。由此可見，Prdx6可通過多種途徑參與細胞凋亡進而對肉的嫩度產生影響。

2.3.3 Prdx6調控sHSPs

熱休克蛋白是機體中廣泛存在的一類熱應激蛋白。熱休克蛋白可參與細胞應激響應，穩定蛋白質結構，增加細胞的存活能力，保護細胞免受氧化應激損傷[54]。許多研究表明，分子質量較小的熱休克蛋白HSP20、HSP27和αβ-晶體蛋白（αβ-crystallin）在骨骼肌中含量較高，與肉品嫩度密切相關[55]。宰后成熟過程中，若Prdx6無法通過自身活性及時清除細胞內過量的ROS，則會使骨骼肌處于氧化應激狀態，該狀態下骨骼肌會迅速合成sHSPs[56]，引起HSP27和αβ-crystallin過量表達[12,55]，抑制肌原纖維的降解，對肉的嫩度造成不良影響。

此外，Prdx6活性不足導致氧化應激時，HSP20和HSP27的過表達會抑制caspase活性，αβ-crystallin會抑制caspase-3活性[57-58]，進而干擾正常的細胞凋亡、細胞自噬進程并抑制骨架蛋白的降解，阻礙肉品嫩化過程。氧化應激同樣會加速HSP70的表達[54]，HSP70可抑制細胞凋亡，同時會抑制肌纖維蛋白的水解[59]，進而延緩肉的成熟過程，降低肉的嫩度。caspase-3在宰后成熟早期參與了calpain特異性抑制劑calpastatin的降解，有助于calpain的激活[60]，提高肉的嫩度。

2.3.4 Prdx6調控細胞自噬

細胞自噬是胞質物質（如胞質醇、蛋白質聚集物和細胞器）的胞內降解途徑。自噬過程中會形成自噬體，吞噬胞質物質將其運輸到液泡或溶酶體進行分解和再循環[61]。氧化應激可誘導自噬的產生[62-63]。研究表明，自噬與細胞凋亡協同作用于細胞死亡，且兩者可相互轉化[64]。促進細胞自噬可誘導凋亡外源性通路中Fas/Fasl的表達，最終活化caspase-3引發細胞凋亡級聯反應。調控自噬會對caspase-3產生影響進而調控結蛋白的降解，提高肉的嫩度[64]。研究表明，細胞內ROS過多會抑制mTOR、p53表達，上調Beclin-1水平，進而誘導自噬的發生。可見，在宰后成熟的過程中，Prdx6可通過抑制ROS累積來減少caspase的激活，進而影響骨架蛋白的降解，最終對肉的嫩度產生影響。Beclin-1是自噬的特異基因，也是自噬的啟動因子[65]，在氧化應激條件下其表達水平上調[66]。此外，Beclin-1還是caspase-3的反應底物，caspase可以裂解Beclin-1，裂解后的Beclin-1會促進Cyt-c的釋放，加速細胞凋亡[67-68]。

3 Prdx6通過調控還原脂質過氧化影響肉品的嫩度

宰后成熟過程中，脂質氧化（主要是細胞膜的氧化）是氧化應激造成細胞損傷的主要機制[69]。如前所述，線粒體外膜的過氧化會導致線粒體外膜透性增加，加速細胞凋亡級聯反應，改善肉的嫩度；脂肪氧化時ROS和脂質自由基會使一些氨基酸殘基轉變為羰基化合物，加劇蛋白質氧化，進而對肉品嫩度造成不良影響。反應猝滅可以終止脂質氧化，但并不能改變已經生成的脂質氫過氧化物。Prdx6除了可以利用自身過氧化物酶活性清除宰后骨骼肌產生的過多的ROS，還可以修復ROS造成的脂質氧化，進而減緩蛋白質氧化和細胞程序性死亡進程，最終對肉品嫩度產生影響。

3.1 Prdx6的PHGPx活性

Prdxs都具有過氧化物酶活性，但只有Prdx6可以還原磷脂氫過氧化物（phospholipid hydroperoxide，PLOOH），該活性被稱為PHGPx活性。通常以PCOOH作為底物來檢測PHGPx活性。敲除Prdx6后，PHGPx活性降低97%[70]，說明氧化態磷脂的還原反應在很大程度上依賴于Prdx6的活性，但Prdx6的活性對磷脂的還原反應并非決定性的。

3.2 Prdx6的PLA2活性

Prdx6還表達PLA2活性[71-72]，因無需Ca2+，故又被稱為非鈣依賴性PLA2（acidic Ca2+-independent PLA2，aiPLA2）活性[73]或溶酶體PLA2活性[74]。該活性在sn-2位點上水解甘油磷脂，對PC底物有明顯偏好。Prdx6的PLA2活性在酸性條件（pH 4）下活性最強，且在單體中即可表達，無需二聚體[25]。胞液pH值下Prdx6的PLA2活性對含有氧化脂肪酸的磷脂酰膽堿活性較高，與酸性條件活性相似[75]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）可以介導Prdx6的T177位點磷酸化[76]，使Prdx6的PLA2活力提高10 倍以上。磷酸化后PLA2活性在胞液pH值下對磷脂底物的還原能力接近酸性條件[77]。

3.3 Prdx6的LPCAT活性

Prdx6還具有LPCAT活性，可以酰化具有一個游離脂肪酸的LPC。與其他溶血磷脂底物相比，Prdx6的LPCAT活性對LPC和sn-2位點上有棕櫚酰輔酶A的脂肪酸有明顯偏好。Prdx6對游離脂肪酸的水解（PLA2活性）和再酰化（LPCAT活性）是一個連續的過程，因此，在棕櫚酰輔酶A存在的情況下，PLA2活性和LPCAT活性共同作用于脂肪酸的sn-2位點上生成磷脂酰膽堿與棕櫚酸鹽[78]。目前，Prdx6是具有LPCAT活性的5 種哺乳動物酶之一[79]，也是唯一同時具有PLA2活性和LPCAT活性的酶。

3.4 Prdx6還原過氧化的脂質

Prdx6的3 種活性都需要結合磷脂底物。通過對Prdx6與磷脂的結合模型的分析得出Prdx6與含有陰離子磷脂的脂質體結合最緊密，對磷脂酰膽堿的活性更強[75]。Prdx6在pH 4時與脂質體磷脂結合能力較好，在pH 7時較差，該規律與PLA2活性一致。此外，磷酸化后的Prdx6在pH 4和pH 7時都能與磷脂緊密結合。這是由于Prdx6磷酸化后呈融球態，此時PLA2活性最大；在許多蛋白質中都存在這一構象與活性的關系規律——與正常條件下折疊的構象相比，融球態使蛋白質結構更加靈活，與底物結合的范圍更廣[80]。

如前所述，Prdx6在胞質中（pH 7）與磷脂的結合能力極低，但與氧化磷脂的結合能力很強，其還原過氧化膜磷脂的過程如圖4所示，磷脂膜未被氧化時，Prdx6存在于胞液中（A）；膜磷脂脂酰殘基被氧化后其親水性增強，浮于膜表面（B）；Prdx6與浮于膜表面的磷脂氫過氧化物底物相互作用（與細胞膜“結合”）（C）；Prdx6對氧化態脂肪酰基進行還原和/或水解（氧化的磷脂水解脫去sn-2脂肪酰基鏈，再酰化恢復到還原態），膜磷脂恢復到還原態后，Prdx6回到細胞質中（D）[81]。如圖3所示，Prdx6與磷脂氫過氧化物底物相互作用（圖4中C、D間的反應）主要通過兩條通路，1）通過PHGPx活性（Prdx6、GPx4）直接還原磷脂氫過氧化物；2）通過脫酰（PLA2活性）/再酰化（LPCAT活性）作用通路修復氧化的脂質。上述兩條通路可以單獨進行，也可同時作用[82]。

圖4 Prdx6還原過氧化膜磷脂示意圖Fig.4 Mechanism of action of Prdx6 in repairing oxidized membrane phospholipids

綜上所述，Prdx6還原過氧化脂質可以：1）減緩蛋白質氧化，改善肉的嫩度；2）降低膜透性，阻礙細胞凋亡關鍵因子Cyt-c流入細胞質，延遲細胞凋亡級聯反應的發生，進而降低caspase-3的激活程度。caspase-3激活程度的降低可直接減緩骨架蛋白降解進程，或通過阻礙calpain的激活間接降低骨架蛋白降解速度，最終對嫩度造成不良影響。

4 結 語

本文闡述了Prdx6通過過氧化物酶活性清除ROS、防止動物屠宰后氧化應激的機制，以及Prdx6通過PHGPx活性、LPCAT活性和PLA2活性還原宰后肌肉中氧化脂質的機制。并進一步總結了Prdx6通過上述活性調控蛋白質與脂質氧化、細胞凋亡、sHSPs、細胞自噬以及還原過氧化膜磷脂影響肉品嫩度的機制。本文對Prdx6影響肉嫩度機制的系統總結完善了肉品嫩化機制，為肉品品質研究提供了新思路。但目前通過調控Prdx6來調控肉品嫩度的研究較少，尚需更多研究證實Prdx6與肉品嫩度之間的相關關系。Prdx6或可成為預測、調控牛肉嫩度的關鍵因子。