CD34、podoplanin與子宮頸癌細胞增殖、血管內皮生長因子的關系及對預后的影響

聶美楠

【摘要】 目的：探究CD34、podoplanin與子宮頸癌細胞增殖、血管內皮生長因子的關系及對預后的影響。方法：選取2015年5月-2017年5月本院子宮頸癌患者106例，均行手術切除治療，留取子宮頸癌組織與癌旁正常組織標本。比較子宮頸癌組織與癌旁正常組織CD34、podoplanin表達情況，分析子宮頸癌組織中CD34與podoplanin的相關性，并對比不同CD34、podoplanin表達子宮頸癌組織增殖基因（Derlin1、SFRP2、TUG1、PRPS2）、血管內皮生長因子[血管內皮生長因子（VEGF）-A、VEGF-C、VEGF-D、血管內皮生長因子受體3（VEGFR-3）]水平，分析CD34、podoplanin與增殖基因、血管內皮生長因子的關系。隨訪3年，統計分析患者3年生存率。結果：子宮頸癌組織CD34、podoplanin陽性表達率、表達量均高于癌旁組織（P<0.05）。子宮頸癌組織中CD34表達量與podoplanin表達量存在正相關關系（P<0.05）。CD34強陽性子宮頸癌組織Derlin1、TUG1、PRPS2表達量高于弱陽性子宮頸癌組織，SFRP2低于弱陽性子宮頸癌組織（P<0.05）;podoplanin陽性子宮頸癌組織Derlin1、TUG1、PRPS2表達量高于陰性子宮頸癌組織，SFRP2低于陰性子宮頸癌組織（P<0.05）;CD34強陽性子宮頸癌組織VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達量高于弱陽性子宮頸癌組織（P<0.05）;podoplanin陽性子宮頸癌組織VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達量高于陰性子宮頸癌組織（P<0.05）。子宮頸癌組織CD34、podoplanin與Derlin1、TUG1、PRPS2、VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3均存在正相關關系，與SFRP2存在負相關關系（P<0.05）。CD34強陽性患者3年生存率低于弱陽性者，podoplanin陽性患者3年生存率低于陰性者（P<0.05）。結論：子宮頸癌組織CD34、podoplanin表達水平與子宮頸癌細胞增殖基因表達、血管內皮生長因子間存在相關性，且CD34、podoplanin陽性表達可降低患者生存率，早期檢測其表達情況有助于評定子宮頸癌預后。

【關鍵詞】 子宮頸癌 CD34 podoplanin 細胞增殖 血管內皮生長因子 生存率

Relationship between CD34， podoplanin and Cervical Cancer Cell Proliferation， Vascular Endothelial Growth Factor and Their Influence On Prognosis/NIE Meinan. //Medical Innovation of China， 2021， 18（13）： 0-028

[Abstract] Objective： To explore the relationship between CD34， podoplanin and cervical cancer cell proliferation， vascular endothelial growth factor and their influence on prognosis. Method： A total of 106 cervical cancer patients in our hospital from May 2015 to May 2017 were selected， all of whom underwent surgical resection， and specimens of cervical cancer tissues and adjacent normal tissues were retained. The expression of CD34 and podoplanin in cervical cancer tissue and normal tissue adjacent to the cancer were compared， and the correlation between CD34 and podoplanin in cervical cancer tissue was analyzed. And the different CD34， podoplanin expression of cervical cancer tissue proliferation genes （Derlin1， SFRP2， TUG1， PRPS2）， vascular endothelial growth factor [vascular endothelial growth factor-A （VEGF-A）， VEGF-C， VEGF-D， vascular endothelial growth factor receptor 3 （VEGFR-3）] levels were compared. The relationship between CD34， podoplanin， proliferation genes and vascular endothelial growth factor was analyzed. Followed up for 3 years， the 3-year survival rate was statistically analyzed. Result： The positive expression rates and levels of CD34 and podoplanin in cervical cancer tissues were higher than those in adjacent tissues （P<0.05）. There was a positive correlation between the expression of CD34 and podoplanin in cervical cancer tissues （P<0.05）. The expression levels of Derlin1， TUG1 and PRPS2 in CD34 strongly positive cervical cancer tissues were higher than those in weakly positive cervical cancer tissues， and SFRP2 was lower than weakly positive cervical cancer tissues （P<0.05）; the expression levels of Derlin1， TUG1 and PRPS2 in podoplanin-positive cervical cancer tissue were higher than those in negative cervical cancer tissue， and SFRP2 was lower than that in negative cervical cancer tissue （P<0.05）; the expression levels of VEGF-A， VEGF-C， VEGF-D， and VEGFR-3 in CD34 strongly positive cervical cancer tissues were higher than those in weakly positive cervical cancer tissues （P<0.05）; the expression levels of VEGF-A， VEGF-C， VEGF-D and VEGFR-3 in podoplanin-positive cervical cancer tissues were higher than those in negative cervical cancer tissues （P<0.05）. CD34， podopranin and Derrin1， Tug1， PRPS2， VEGF-A， VEGF-C， VEGF-D and VEGFR-3 were positively correlated with cervical cancer tissues， and there was a negative correlation with SFRP2 （P<0.05）. The 3-year survival rate of CD34-positive patients was lower than that of weak-positive patients， and the 3-year survival rate of podoplanin-positive patients was lower than that of negative patients （P<0.05）. Conclusion： The expression levels of CD34 and podoplanin in cervical cancer tissues are correlated with the expression of proliferation genes and vascular endothelial growth factor in cervical cancer cells. Moreover， the positive expression of CD34 and podoplanin can reduce the survival rate of patients， and early detection of the expression of CD34 and podoplanin is helpful to evaluate the prognosis of cervical cancer.

[Key words] Cervical cancer CD34 podoplanin Cell proliferation Vascular endothelial growth factor

Survival rate

First-authors address： Hong Da Hospital of Jiamusi University， Jiamusi 154002， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.13.006

子宮頸癌是全球范圍內女性第二大惡性腫瘤，每年可導致26萬人死亡，我國當前子宮頸癌的發生率逐漸增高，且呈現年輕化趨勢，早期確診疾病、明確病情是當下該病治療結局優化的關鍵環節[1-2]。轉移和侵襲是惡性腫瘤的基本特征，子宮頸癌尤以淋巴轉移為主，是導致患者死亡的主要原因[3]。近年來研究發現，podoplanin是一個特異性表達于淋巴管內皮的分子，被認為是淋巴管內皮特異性標記物，具有促進腫瘤淋巴管形成的作用，且與腫瘤預后密切相關[4]。CD34是一種血管標記物，其陽性表達可刺激腫瘤組織中脈管的增加，促進腫瘤的轉移、浸潤[5-6]。但目前關于CD34、podoplanin在子宮頸癌組織中表達情況的研究較少，其具體應用價值尚未明確。基于此，本研究嘗試探究CD34、podoplanin與子宮頸癌細胞增殖、血管內皮生長因子的關系及對預后的影響，旨在探尋子宮頸癌靶向治療的新途徑。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年5月-2017年5月本院子宮頸癌患者106例，納入標準：符合子宮頸癌診斷標準[7]，并經術后病理診斷確診;病理分型均為鱗癌;入組前未接受手術、放化療治療;首次確診;自主行為能力良好，能配合完成研究。排除標準：合并其他惡性腫瘤;嚴重感染性疾病;血液系統疾病;嚴重心腦血管疾病;既往有宮頸手術史;入組前6個月內有嚴重創傷或手術史;自身免疫性疾病;妊娠期或哺乳期女性。年齡40～78歲，平均（61.28±8.35）歲;體質量指數（body mass index，BMI）19.5～28.1 kg/m2，平均（25.12±1.45）kg/m2;絕經情況：絕經82例，未絕經24例;合并癥：冠心病15例，高血壓21例，糖尿病12例，高血脂17例;臨床分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期42例，Ⅲa期41例;有淋巴結轉移者35例。所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書，且本研究已經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 CD34、podoplanin表達檢測 所有患者均行手術切除治療，留取子宮頸癌組織與癌旁正常組織標本，采用中性福爾馬林液中固定保存，常規進行脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，4 μm厚連續切片，采用MY-AU60型全自動免疫組化染色儀[生產廠家：上海永創醫療器械有限公司，批準文號：滬食藥監械（準）字2014第1400017號]，以免疫組化發檢測子宮頸癌組織與癌旁正常組織CD34、podoplanin表達情況，免疫組化染色試劑盒購自上海長島生物技術有限公司[批準文號：滬食藥監械（準）字2011第1400917號，規格：300人份]，用磷酸鹽緩沖液[生產廠家：上海長島生物技術有限公司，批準文號：滬食藥監械（準）字2013第1401159號，規格：濃縮液1×50 mL]代替一抗作陰性對照。于高倍顯微鏡下（倍數10×40）進行結果判定，隨機選取5～10個高倍視野，每個視野計數100個瘤細胞，計數陽性細胞百分比。按著色細胞百分比分級，無著色細胞或<10%為陰性（-），陽性細胞數10%～25%為弱陽性（+）;陽性細胞數26%～50%為陽性（++）;陽性細胞數>50%為強陽性（+++）。于低倍顯微鏡下（倍數10×10）下尋找癌灶內部和癌灶邊緣組織陽性淋巴管密集區域，高倍鏡下觀察并計數，以5個高倍鏡視野中陽性脈管的平均數表示。

1.2.2 子宮頸癌組織增殖基因檢測 采用實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術監測子宮頸癌組織增殖基因表達量，包括Derlin1、SFRP2、TUG1、PRPS2，設置宮頸正常組織中上述基因表達量為標準值，計算子宮頸癌組織增殖上述基因的相對表達量。

1.2.3 血管內皮生長因子水平檢測 切取適量子宮頸癌組織30 mg，加入200 μL磷酸鹽緩沖液，充分勻漿后離心分離上層澄清液，置于-70 ℃冷藏室保存，采用酶聯免疫吸附試劑盒測定血管內皮生長因子水平，包括血管內皮生長因子（vascular epithelial growth factor，VEGF）-A、VEGF-C、VEGF-D、血管內皮生長因子受體3（vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3），試劑盒購自遼寧邁迪生物科技有限公司，檢測操作均由專業人員嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 觀察指標 （1）子宮頸癌組織與癌旁正常組織CD34、podoplanin表達情況。（2）分析子宮頸癌組織中CD34與podoplanin的相關性。（3）不同CD34、podoplanin表達子宮頸癌組織增殖基因（Derlin1、SFRP2、TUG1、PRPS2）、血管內皮生長因子（VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3）水平。（4）分析CD34、podoplanin與增殖基因、血管內皮生長因子的關系。（5）隨訪3年，統計分析患者3年生存率，并比較不同癌旁正常組織CD34、podoplanin表達患者的3年生存率。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料采用Bartlett方差齊性檢驗與Kolmogorov-Smirnov正態性檢驗，均確認具備方差齊性且近似服從正態分布，用（x±s）表示，比較采用獨立樣本t檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。相關性分析采用Pearson相關系數模型。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮頸癌組織與癌旁正常組織CD34、podoplanin表達情況比較 子宮頸癌組織CD34、podoplanin陽性表達率與表達量均較癌旁組織高（P<0.05），見表1。其中CD34將微血管內皮染為棕黃色（見圖1a）;podoplanin陽性染色主要位于腫瘤淋巴內皮細胞胞漿，為棕褐色顆粒，呈彌漫性分布（見圖1b）。

2.2 子宮頸癌組織中CD34與podoplanin相關性 Pearson相關性分析，子宮頸癌組織中CD34表達量與podoplanin表達量呈正相關（r=0.701，P<0.05），見圖2。

2.3 不同CD34、podoplanin表達子宮頸癌組織細胞增殖情況 CD34強陽性子宮頸癌組織Derlin1、TUG1、PRPS2表達量均較弱陽性子宮頸癌組織高，SFRP2較弱陽性子宮頸癌組織低（P<0.05）;podoplanin陽性子宮頸癌組織Derlin1、TUG1、PRPS2表達量均較陰性子宮頸癌組織高，SFRP2較陰性子宮頸癌組織低（P<0.05）。見表2。

2.4 不同CD34、podoplanin表達子宮頸癌組織血管內皮生長因子表達水平 CD34強陽性子宮頸癌組織VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達量均較弱陽性子宮頸癌組織高（P<0.05）;podoplanin陽性子宮頸癌組織VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達量均較陰性子宮頸癌組織高（P<0.05），見表3。

2.5 子宮頸癌組織CD34、podoplanin與細胞增殖、血管內皮生長因子相關性 Pearson相關性分析，子宮頸癌組織CD34、podoplanin與Derlin1、TUG1、PRPS2、VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3呈正相關，與SFRP2呈負相關（P<0.05），見表4。

2.6 不同CD34、podoplanin表達者隨訪情況及生存情況比較 隨訪3年，失訪5例。完成隨訪的101例子宮頸癌患者3年生存率為61.39%（62/101）。Kaplan-Meier生存曲線分析，CD34強陽性患者3年生存率46.05%（35/76）低于弱陽性者13.33%（4/30），podoplanin陽性患者3年生存率40.66%（37/91）低于陰性者13.33%（2/15）（字2=9.229、4.346，P=0.002、0.037）。

3 討論

子宮頸癌的發生發展依賴血管形成，轉移途徑主要為直接蔓延和淋巴結轉移，癌組織中微脈管的變化一直是近年國內外研究的熱點[8-9]。

CD34是目前公認的血管標記物，作為一種高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，其選擇性表達與人造血干細胞、血管內皮細胞及祖細胞表面[10]。林韻等[11]研究指出，CD34在腫瘤性小血管內皮細胞中表達增加，是與新生小血管密切相關的標記物。本研究發現，子宮頸癌組織CD34陽性表達率、表達量均高于癌旁組織，提示子宮頸癌病灶組織內微血管的生成與腫瘤的生長有密切關系。腫瘤微淋巴管系統的研究起步相對微血管較晚，主要在于缺少特異性標記物，使淋巴管的研究、發展受到限制[12]。隨著對淋巴管的一些特異標記物的發現與鑒定，如podoplanin，給腫瘤研究開拓了新視野和新途徑[13]。podoplanin是一種43 kD膜蛋白，具有控制足細胞形態的作用，其存在于淋巴管內皮細胞，且僅出現在小淋巴管，是較為理想的微淋巴管標記血管物[14-15]。國內相關報道顯示，隨著病變的加重，podoplanin陽性表達率逐步增加，有助于協助臨床病理醫師更快速地定位可疑浸潤區，提升診斷效率[16]。本研究發現，子宮頸癌組織podoplanin陽性表達率、表達量均高于癌旁組織，且主要集中于癌灶邊緣，podoplanin能特異性標記淋巴管，尤其毛細淋巴管，提示癌灶周邊組織存在有功能的淋巴管，癌灶周邊的癌細胞脫落進入淋巴管形成瘤栓，致瘤細胞發生轉移。

本研究通過相關性分析發現，子宮頸癌組織中CD34表達量與podoplanin表達量間存在正相關關系，提示子宮頸癌病灶組織內的微血管與淋巴管的形成可能相互促進，可能是腫瘤增殖、浸潤、轉移的機制之一。此外，隨著子宮頸癌組織CD34、podoplanin陽性表達增加，子宮頸癌組織Derlin1、TUG1、PRPS2及VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達量隨之升高，SFRP2表達量降低。其中Derlin1是調節內質網跨膜逆向轉運的跨膜蛋白，具有拮抗內質網介導的細胞凋亡的作用，TUG1是一類能夠拮抗p53活性的基因，具有抗細胞凋亡作用，可抑制腫瘤細胞凋亡，PRPS2可調節核苷酸合成、加速細胞周期進程，均為促進腫瘤增殖的基因，而SFRP2通過拮抗Wnt通路來抑制細胞增殖[17-18]。VEGF是目前已知促血管新生效應最強的細胞因子，包括VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D，能夠與其受體VEGFR結合，發揮細胞生長、血管結構形成的作用[19]。筆者認為，CD34、podoplanin陽性表達與子宮頸癌的增殖、血管生成關系密切。本研究通過隨訪研究發現，CD34強陽性及podoplanin陽性患者3年生存率均較低，可能在于兩者的陽性表達能促進腫瘤細胞增殖和微血管形成，從而促進疾病的生長、轉移，增加病死率。

綜上所述，子宮頸癌組織內CD34、podoplanin陽性表達明顯升高，與子宮頸癌細胞增殖基因表達、血管內皮生長因子密切相關，且能降低患者3年生存率，早期檢測其表達情況有助于臨床制定治療方案。本研究創新之處在于明確了CD34、podoplanin與子宮頸癌細胞增殖、血管內皮生長因子的關系及對預后的影響，后期研究中將進一步探究其在子宮頸癌靶向治療方面的作用，充分發掘兩者臨床價值。

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（收稿日期：2020-08-19） （本文編輯：田婧）