馬鈴薯晚疫病抗性分子育種研究進展

王芳

摘要：馬鈴薯晚疫病是由疫霉引起的一種世界性的流行性和毀滅性病害，每年造成巨大的產量損失。抗性品種培育一直是育種學家追求的目標。常規(guī)育種方法具有耗時費力等特點，目前分子植物育種在馬鈴薯晚疫病抗性育種中被應用或作為輔助應用。綜述了馬鈴薯晚疫病的發(fā)生及防治，分子標記技術在馬鈴薯晚疫病抗性和晚疫病抗性育種中的研究進展，以及馬鈴薯晚疫病抗性基因定位、基因工程、轉錄組分析和全基因組關聯分析等方面的研究進展，并對未來馬鈴薯育種策略進行了展望，以期為馬鈴薯晚疫病抗性分子育種提供理論參考。

關鍵詞：馬鈴薯;晚疫病抗性;分子育種;研究進展

中圖分類號：S435.32 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）10-0014-05

馬鈴薯（Solanum tubersum L.）起源于南美洲，是世界第三大糧食作物，也是緩解全球糧食危機的重要作物[1]。中國是全球馬鈴薯生產第一大國[2]。馬鈴薯在我國是第四大主糧作物，其產業(yè)已經成為農村經濟發(fā)展的重要支柱[3]。而馬鈴薯生產過程中均有受到晚疫病不同程度的侵害，給馬鈴薯生產帶來困擾。

1 馬鈴薯晚疫病發(fā)生及防治

馬鈴薯晚疫病（potato late blight，PLB）是由致病疫霉[Phytophthora infestans （Mont.） de Bary]引起的馬鈴薯重要病害[4]，是世界性的流行性和毀滅性病害，每年造成巨大的產量損失。

晚疫病于1830年首次在德國被發(fā)現，1845年比利時報道了該病的發(fā)生，此后晚疫病在法國、荷蘭、蘇格蘭、芬蘭、意大利、丹麥、英格蘭等國家均有發(fā)生[5]。1940年中國在重慶發(fā)現晚疫病發(fā)病，當年造成馬鈴薯減產80%。1950年開始，晚疫病在中國普遍流行，當時察哈爾、山西、綏遠等地的馬鈴薯損失產量超過50%[5]。綜合危害程度、防治難度及對社會的影響，晚疫病已經成為全球第一大馬鈴薯病害[5-10]。中國每年因晚疫病感染而造成的馬鈴薯減產達10%～15%[11]，嚴重產區(qū)鮮薯損失達到15%～40%，甚至絕收[12]。由此帶來的損失每年約80億元人民幣，嚴重阻礙了馬鈴薯的生產和產業(yè)化發(fā)展[5]。

晚疫病的發(fā)生與傳播有4個階段：孢子囊萌發(fā)與侵染—生長病斑—孢子囊產生與釋放—孢子囊傳播[13]，并且在適宜的環(huán)境下循環(huán)發(fā)生[14]，晚疫病的卵菌感染植株和薯塊，導致黑色病變并快速摧毀整個植株[15]。孢子在馬鈴薯塊莖或其他茄科宿主中越冬，馬鈴薯致病疫霉（P.infestans，PI）快速對馬鈴薯防御機制產生抗性[16]。因此，需要育種家持續(xù)不斷尋找新的抗性基因[16-19]。

目前，馬鈴薯晚疫病的防治主要采取生物防治和化學防治，由于生物防治見效慢，因此化學防治成為主要措施。而化學防治不僅會造成生產投入高，還會帶來嚴重的環(huán)境污染。同時，由于菌株的抗藥性問題日益突出，防治效果不理想，增加了化學防治的難度。基于以上原因，防治晚疫病最好的方法是選用無病種薯和抗病品種[20]。目前，缺乏優(yōu)良的晚疫病持久抗性品種仍然是馬鈴薯生產中的主要問題之一。因此，尋找新的抗性資源、解析持久抗性機理、選育持久抗性品種，是育種學家們一項重大而緊迫的任務。

除了使用常規(guī)育種方法進行馬鈴薯品種改良之外，利用分子標記技術對晚疫病抗性基因、轉基因、功能基因和基因定位的研究逐漸應用于馬鈴薯育種工作中。2 分子標記方法研究馬鈴薯晚疫病抗性

2.1 馬鈴薯晚疫病抗性基因定位研究進展

已報道的關于馬鈴薯晚疫病抗性的研究有兩大類：質量抗性研究和數量抗性研究。質量抗性被認為是垂直抗性（vertical resistence），包括定位和克隆具有小種特異性和小種轉化性基因。目前，已經有20多個晚疫病抗性R基因被克隆出來。在野生種（S.demissum）中，發(fā)現了R1～R11的11個小種特異性抗性基因R（resistance gene），其中一部分R基因己經被定位或克隆，并轉移到馬鈴薯栽培種（品種）當中[21-22]。大多數馬鈴薯品種中有R基因，通常有1個或幾個表現為小種特異性的R基因，研究顯示馬鈴薯植株所含R基因越多，其抗譜范圍越廣，暗示含有較多的R基因可能有利于提高馬鈴薯抗性水平[23-25]。抗性水平較高時，能引起HR反應（high resistance）。但是，當新的侵染能力更強的PI克服這些R基因時，其抗性立即喪失[26-27]。R基因的積累被認為是傳統育種策略和基因改良育種策略中，最有希望提供馬鈴薯晚疫病持久抗性的方法之一[28]。

除了質量性狀抗性R基因外，在數量抗性研究中，定位了一系列馬鈴薯晚疫病數量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）。由多基因控制的數量抗性，對多個PI小種產生抗性[29]。由于馬鈴薯四倍體遺傳復雜，晚疫病水平抗性QTL定位在四倍體馬鈴薯中的研究較少，利用二倍體進行晚疫病抗性基因QTL定位居多。隨著生物技術的發(fā)展，除了采取傳統方法對晚疫病進行研究之外，分子標記技術也逐漸被引入。用于晚疫病抗性QTL定位的群體類型主要有4種：（1）親本均為栽培種的種內雜交群體;（2）栽培種富利亞種（S. phureja）和栽培種（S. tuberosum L.）之間的雜交群體;（3）馬鈴薯野生種和栽培種之間的雜交群體[30-32];（4）栽培種富利亞種（S.phureja）與野生種（S.stenotomum）的雜交群體[33-34]。從這些群體中定位的QTL結果來看，12條染色體上均有QTL分布，染色體3、4、5的出現頻率最高。但是，在大多數情況下，一些非理想性狀與晚疫病抗性QTL相關聯，其中之一就是晚熟性狀，晚熟性狀限制了晚疫病QTL的應用。在5號染色體上，GP21和附近的QTL在不同環(huán)境和不同群體中均表現出較高的穩(wěn)定性，但是這個QTL與成熟期或晚熟性相關聯，所以其應用價值受到限制[4，36]。李竟才利用二倍體馬鈴薯B3C1HP群體的遺傳連鎖圖譜，應用條件QTL分析馬鈴薯晚疫病數量抗性，有6個條件QTL被定位（dPI02、dPI7、dPI09a、dPI09b、dPI09c、dPI12）[3]。所有的條件QTL表達模式都表現為即時性。通過對由感病親本12601abl和抗病品種Stirling雜交構成的227個后代株系的四倍體群體進行研究發(fā)現，5號染色體上定位的1個QTL與早熟、更感晚疫病、較矮的植株等性狀相關聯，能解釋成熟期（54.7%）、株高（26.5%）、塊莖晚疫病抗性（26.3%）和葉片晚疫病抗性（17.5%）等表型變異;同時，在品種Stirling 4號染色體上定位的1個QTL不受成熟期影響，能解釋塊莖晚疫病抗性表型變異的30.7%和葉片晚疫病抗性表型變異的13.6%[36]。Mihovilovich等研究結果表明，基因型、PI小種和日長之間的互作效應顯著[19]。目前尚不明確這是一個相互獨立或者是存在2個緊密連鎖基因，還是既影響晚疫病抗性又影響成熟期的多效基因。此外，與復雜抗病性狀一樣，因PI分離種、不同的群體種類、抗性評價方法、QTL定位方法、環(huán)境條件不同等，晚疫病抗性QTL在以上群體間表現出的一致性較差。

基因研究的不斷深入，推動了顯示所知基因和/或遺傳標記相對位置遺傳圖譜的發(fā)展。Danan等整合構建了包含2 141個晚疫病抗性QTL定位標記的圖譜，匯集了144個已報道的晚疫病抗性QTL，這些QTL表型貢獻率為4%～63%[37]。通過構建原始群體B3C1HP100，獲得共206個單株的重組子群體B3C1HP106/4000，結合表型數據分析和基因型鑒定，獲得了3個重組單株，將dPI09c區(qū)間縮小到289 kb范圍[38]。Albert等采用候選基因的方法，在晚疫病抗性QTL位點上鑒定了一個內囊體腔蛋白StTL15A和一個糖蛋白StGP28[39]。

以上所述QTL定位方法主要有SSR、AFLP、RAPD、CAPs等方法，是在人為控制雜交產生的分離群體中分析得出的，得到了不相同的晚疫病QTL。究其原因，研究群體遺傳背景不盡相同，發(fā)生分離的QTL也不一樣。

2.2 馬鈴薯晚疫病抗性基因工程研究進展

隨著基因工程的發(fā)展，馬鈴薯晚疫病抗性基因工程育種研究也逐漸開始，主要是把馬鈴薯野生種中的抗病基因轉入栽培種，從而提高晚疫病抗性。自20世紀80年代以來，已有十幾個野生種中的晚疫病抗性基因被導入栽培種[40]。許多蛋白對晚疫病菌具有抗性，通過轉基因，把病程相關蛋白基因和抗病基因等轉入栽培種中，能夠顯著提高馬鈴薯晚疫病抗性。例如，病程相關蛋白基因：HatpinEa蛋白基因[41]、Osmotin基因[42]、類甜蛋白[43]、幾丁質酶基因[44]、來源于馬鈴薯的乙烯反應元件結合蛋白ethylene responsive element binding proteins的StEREBP1基因[45]和來源于Nicotiania megalosiphon的NmDef02基因[45];抗病基因：RB、R1、R3a等基因[46-48]，無毒基因Elicitin、avrD[49]，質類受體激酶基因[50]，馬鈴薯StBAG3基因[51]。小熱激蛋白 sHSP-F 基因通過接種晚疫病脅迫誘導后，其表達量在24 h和48 h內顯著上調[52]。此外，還有類糖基轉移酶基因StKOB1[53]、β-氨基丁酸誘導的StWRKY8基因[54]、植物本氏煙中StRFP1的同源基因NbATL60RD24和PITG15718.2[55-57]、馬鈴薯野生種S.demissum中11個主效R基因，均被導入栽培種中，已經作為抗性資源廣泛應用[58-59]。

2.3 馬鈴薯晚疫病抗性基因克隆研究進展

2006年報道了一種基于聚合酶鏈反應的DNA標記物，該標記物可用于追蹤馬鈴薯球蛋白體細胞雜交種的RB基因[60]。Song等克隆了RB基因，為馬鈴薯晚疫病抗性品種的開發(fā)提供了新的資源[61]。此外，R1、R2、R3a、R3b、RB、R8等基因被克隆，并開發(fā)了相應的分子標記[25]。

2.4 馬鈴薯晚疫病抗性轉錄組分析

為了尋找和利用新的晚疫病抗性資源，需要采用先進的方法和技術進行晚疫病抗性和基因型分析，揭示馬鈴薯晚疫病抗性的遺傳基礎和分子機制，從而加快馬鈴薯晚疫病持久抗性品種的培育進程，為穩(wěn)定和提高馬鈴薯單位面積產量奠定基礎，以及進一步研究晚疫病持久抗性的分子機理提供理論依據。

高通量測序又稱下一代測序技術，該技術的發(fā)展和應用使得馬鈴薯轉錄組分析成為可能，又被稱為深度測序（deep sequencing）。通過對接種致病疫霉菌后不同時段的材料進行轉錄組測序，共檢測到2 107個LRR類基因（富亮氨酸重復序列）。對這些差異表達的LRR基因進行聚類分析發(fā)現，LRR基因在接種后不同時段材料中均有表達，在抗病材料中有91個上調，差異表達明顯[62]。

利用cDNA微陣列技術檢測接種晚疫病菌的馬鈴薯試驗材料，通過分析獲得到與疫病抗病相關的基因348個，發(fā)現增加了調控基因和防御路徑基因[63]。這些研究為功能基因挖掘和鑒定提供了非常重要的參考依據。利用RNA-seq對馬鈴薯葉片侵染致病疫霉菌初期的RXLR效應基因的表達特征進行分析，并根據分析結果和序列進化分析篩選到多個RXLR候選效應基因，這些結果可用于抗病基因的篩選工作。一方面可以用于尋找相應抗病基因和引進抗病品種，另一方面通過監(jiān)測這些效應因子及時判斷對應的抗病基因是否被克服[64]。但是，轉錄組數據不僅耗費大量人力、物力和經費，其結果也未能得到深度挖掘。

2.5 馬鈴薯晚疫病抗性全基因組關聯分析

盡管取得了很多成就，但是我們所知的大部分復雜性狀的遺傳結構，是利用傳統的雙親群體構建的數量性狀位點（QTL）遺傳圖譜獲得的。目前，用QTL方法觀察作物資源基因的潛在和巨大表型變異，很顯然不能“勝任”更深入的研究結果。近幾年，基因組技術快速發(fā)展，2011年馬鈴薯基因組測序完成，這為馬鈴薯的遺傳學研究及分子育種提供了非常有價值的資源[65]。關于擬南芥（http：//walnut.usc.edu/2010）、玉米（http：//www.panzea.org）、水稻 （http：//irfgc.irri.org）等進行的全基因組關聯分析，為GWAS的快速發(fā)展奠定了基礎。全基因組關聯分析（genome-wideassociation study，GWAS）已經成為復雜性狀的重要研究手段。

全基因組關聯分析（GWAS）是將觀察到的表型變異和常見遺傳變異總體在全基因組范圍內進行的關聯分析，可以全方位地提示性狀發(fā)生、發(fā)展和調控的相關遺傳機制。GWAS有如下優(yōu)點：（1）在研究之前，不必構建任何假設;（2）除了遺傳群體，還可利用自然群體，極大縮短研究年限;（3）可同時檢測成千上萬個SNPs，進行全基因組范圍內的整體研究，（4）精度大大提高，例如，利用GWAS技術，玉米的作圖精度可從10～30 cM提高到 1 500 bp[66]。隨著生物信息學的高度發(fā)展、測序技術的提高和成本的降低，GWAS成為揭示遺傳機制、挖掘抗性性狀和剖析作物農藝性狀的有效方法[67-68]。通過對擬南芥的抗病性和開花期進行全基因組關聯分析，已經克隆了與抗病性相關的基因Rpm、Rps2、Rps5以及控制花期基因FRI[69]，這是全基因組關聯分析首次在植物中的應用。

目前，全基因組關聯方法在馬鈴薯晚疫病抗性方面的研究很少。利用SNP標記，通過區(qū)域選擇消除分析馬鈴薯抗晚疫病基因，有19個基因序列被注釋為馬鈴薯中的R基因[70]。

3 展望

馬鈴薯晚疫病是影響全球馬鈴薯產業(yè)發(fā)展的限制因素之一，晚疫病抗性基因在現有的主要栽培種中遺傳基礎狹窄，需要導入野生資源中的優(yōu)異抗性基因。但是，野生種資源與栽培種資源之間存在雜交不親和等障礙，同時馬鈴薯復雜的四倍體遺傳機制也限制了優(yōu)異抗性基因的導入。分子生物學和高通量基因技術的發(fā)展，極大地影響了分子植物育種，引領著育種工作從基于表型選擇到基于基因型選擇。因此，綜合運用基因組和分子工具進行馬鈴薯常規(guī)表型選擇已經成為新的育種策略。從野生種中鑒定抗性關鍵基因，運用先進的轉基因工程技術，輔助常規(guī)育種培育轉基因抗病馬鈴薯，將成為防治馬鈴薯晚疫病的重要的手段。

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