不同施肥處理對當歸藥材質量的影響

彭桐 王引權 李欽 荔淑楠 魏麗娟 黨昇榮

摘要：以不施肥為對照，探究單施有機肥、施用生物有機肥加復合肥、單施復合肥，研究不同施肥處理對當歸藥材質量的影響，為當歸栽培的合理施肥提供理論依據。參照2020年版《中華人民共和國藥典》中四部方法測定當歸水分、總灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物含量，采用甲苯法測定當歸中多糖含量;采用高效液相色譜法（HPLC）測定當歸中阿魏酸、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯I等7種化學成分的含量。結果表明，單施有機肥可顯著降低當歸藥材的水分含量，提高浸出物含量;生物有機肥+復合肥處理可降低總灰分和酸不溶性灰分含量并提高浸出物含量;4種施肥處理之間當歸多糖含量并無顯著性差異;根據主成分分析結果，單施復合肥和單施有機肥可促進當歸中7種主要藥效成分含量的提高。綜合來看，本研究中當歸的最佳施肥條件為單施有機肥4 797.6 kg/hm2。

關鍵詞：施肥;當歸;質量;HPLC;主成分分析

中圖分類號： S567.23+9.06 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）10-0126-06

當歸為傘形科植物當歸[Angelica sinensis （Oliv.） Diels.]的干燥根，有補血活血，調經止痛和潤腸通便的功效[1]。目前臨床上使用的當歸藥材多為栽培品，甘肅省定西市岷縣、漳縣、隴南市宕昌縣等地為當歸藥材的道地產區[2]，占全國市場流通量的70% 以上[3]。目前，在當歸種植過程中由于連作和大量施用化肥，造成土壤板結、土壤質量下降，土壤特性不穩定等問題，從而影響了當歸品質。有研究證實恰當施肥不僅能促進當歸的生長發育，提高藥材產量，還可改善藥材品質[4]。鑒于此，筆者所在課題組研究設計了單施有機肥、單施復合肥、有機肥與復合肥配施3種施肥方式，以不施肥為對照，對當歸藥材的質量影響進行試驗研究。本研究以當歸藥材中當歸多糖的含量和有機酚酸類（阿魏酸、阿魏酸松柏酯）跟苯酞類（洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A、藁本內酯、歐當歸內酯）7種化學成分的含量[5-6]作為評價指標。同時結合當歸的水分、總灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物的含量對當歸藥材質量進行綜合分析比較，為確定最佳施肥方案提供科學依據。以期為當歸的生態化種植及質量控制提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

本試驗于2019年4—11月在甘肅省定西市岷縣蒲麻鎮包家溝村進行，海拔約2 600 m，二陰區坡地，地塊較平坦，前茬為燕麥。試驗地于4月中旬移栽當歸前翻地。翻地后，搶墑覆膜，膜寬0.6 m，壟間距30 cm。并按地塊條件劃定小區。

1.2 試驗樣品

供試當歸種苗選用2018年合作社繁育的當歸苗，移栽時按DB62/T 2549―2014《中藥材種苗 當歸》標準挑選一級苗（莖粗3～5 mm，試驗隨機取10株當歸苗進行苗長、苗鮮質量、莖基直徑、分叉數測定）。挑選好的當歸苗用甘肅省科學院開發的微生物菌劑浸苗15 min，晾干種苗表皮水分后移栽。供試肥料信息見表1。

1.3 儀器及試劑

高效液相色譜儀（型號：Agilent1200，美國安捷倫公司）;電子分析天平（型號：BT125D，賽多利斯科學儀器北京有限公司）;超純水系統（型號：Smart-N15VF，上海力康醫療設備有限公司）。

乙腈（天津市大茂化學試劑廠，批號20180618，色譜純），甲醇（天津市大茂化學試劑廠，批號20160307，色譜純），冰乙酸（天津市大茂化學試劑廠，批號20170205，色譜純）。對照品溶液均購于上海源葉生物科技有限公司，具體有阿魏酸對照品（批號H27J7L16718）、洋川芎內酯I對照品（批號P02F9F54166）、洋川芎內酯H對照品（批號P02F9F54165）、洋川芎內酯A對照品（批號P23A9F68613）、正丁基苯酞對照品（批號S09J9D65229）、Z型藁本內酯對照品（批號Y17S9L70462）、歐當歸內酯對照品（批號P24A9S68617）、阿魏酸松柏酯對照品（批號Z24D9B78131）。

1.4 試驗設計

試驗采用單因素隨機區組設計，3次重復，每小區面積為2.4 m×12.5 m=30 m2。總占地400 m2。試驗共設4個處理，處理1：單施有機肥4 797.6 kg/hm2;處理2：生物有機肥1 799.1 kg/hm2+復合肥 1 199.4 kg/hm2;處理3：單施復合肥7 496.3 kg/hm2;處理4：不施肥（CK）。各處理小區均在播種前施肥，生育期間不施肥。

1.5 試驗方法

1.5.1 常規指標測定方法 參照2020年版《中華人民共和國藥典》四部方法中的通則0832第四法測定當歸藥材水分、通則2302測定總灰分和酸不溶性灰分含量和通則2201測定醇溶性浸出物含量。

1.5.2 多糖含量的測定 （1）對照品儲備液的制備。將葡萄糖對照品于105 ℃下烘干至完全失去水分，精密稱取干燥恒質量后的葡萄糖對照品5.3 mg放入50 mL容量瓶中，加水搖勻定容，得葡萄糖對照品儲備液。（2）供試品溶液的制備。稱取過60目篩后的當歸樣品粉末約1 g，加入80%乙醇 100 mL 后加熱回流1 h，過濾得濾渣加100 mL蒸餾水加熱回流2 h，濾液濃縮后加80%乙醇沉淀，靜置過夜后離心，沉淀用溫水溶解后定容至100 mL容量瓶，精密量取上述溶液1 mL定容于25 mL量瓶中得供試品溶液。于干燥具塞試管中，依次加入供試品溶液1.0 mL，1.0 mL蒸餾水，2.0 mL 5%苯酚溶液，7.0 mL 濃硫酸，混勻后沸水浴加熱20 min進行顯色。顯色后的溶液需自來水水浴冷卻5 min后再測定其吸光度。

1.5.3 高效液相色譜法（HPLC）測定當歸中7種化學成分的含量 （1）色譜條件。Merk RP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為1%乙酸（A）：乙腈（B），梯度洗脫：（0～20 min，19%B;20～60 min，19%～95%B;60～75 min，95%～100%B）;檢測波長260、280、300 nm;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量 20 μL。在該色譜條件下，選擇波長為280 nm時色譜峰峰形與分離度良好。（2）對照品溶液的制備。精密稱取阿魏酸對照品0.006 45 g，阿魏酸松柏酯0.003 01 g，洋川芎內酯I 0.000 75 g，洋川芎內酯H 0.000 72 g，洋川芎內酯A 0.004 23 g，歐當歸內酯0.000 96 g，分別加甲醇定容于5 mL容量瓶中作儲備液，稱取藁本內酯0.005 43 mg，定容至加甲醇 1 mL 容量瓶內，作為儲備液。精密移取洋川芎內酯H儲備液0.3 mL，歐當歸內酯0.2 mL，藁本內酯儲備液1 mL，其余各儲備液分別移取 0.5 mL 于同一容量瓶，定容至5 mL容量瓶內得混合對照品溶液，對照品溶液在注入液相色譜儀前需經0.22 μm微孔濾膜過濾。繪制標準曲線，見圖1。（3）供試品溶液的制備。精密稱取過2號篩后的當歸藥材粉末0.500 g于150 mL錐形瓶中，加入70%甲醇 20 mL 后稱質量，將錐形瓶口密封后置于超聲儀器內，在220 W，80 Hz條件下超聲40 min，取出后冷卻并稱質量，70%甲醇補足質量，抽取混勻溶液后用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得到供試品溶液。供試品溶液需在4 ℃冰箱內儲藏。

1.6 統計方法

使用 Excel 2013 軟件進行數據的初步換算和處理，試驗數據采用 SPSS 21. 0軟件進行主成分分析、顯著性檢驗（P<0. 05）和Duncans多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理的當歸藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量測定分析

從表2可以看出，各施肥處理下當歸藥材的水分均小于15.0%，總灰分含量小于7.0%，酸不溶性灰分含量小于2.0%，浸出物含量均超過45.0%，均達到2020年版《中華人民共和國藥典》標準。單施有機肥可顯著降低藥材水分含量，提高浸出物含量，該處理下藥材總灰分和酸不溶性灰分含量較高。生物有機肥+復合肥處理下與不施肥相比，總灰分和酸不溶性灰分含量分別降低了9.47%、35.46%。

2.2 多糖含量測定分析

2.2.1 標準曲線的制備 移取葡萄糖對照品儲備液0.2、0.4、0.6、0.7、0.8 mL，分別置于10 mL試管中進行顯色，待冷卻后在490 nm下測定其吸光度[7]，以空白溶液為對照。以吸光度（Y）對葡萄糖溶液濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程Y=68.461X+0.025 3（R2=0.9994），線性范圍為2.12～8.48 mg/L。

2.2.2 穩定性試驗 按“1.5.2”節供試品溶液的制備方法制備處理1當歸樣品進行顯色后，分別在 0、10、20、30、40、50、60 min測定吸光度，測定結果RSD為3.1%，說明供試品溶液在1 h內穩定。

2.2.3 重復性試驗 取過篩后處理1當歸樣品共6份，按“1.5.2”節供試品溶液的制備方法制備供試液，顯色后測定吸光度。測定結果RSD為4.5%，說明重復性良好。

2.2.4 精密度試驗 吸取“1.5.2”節對照品溶液0.6 mL并顯色，依法連續測定6次吸光度，當歸多糖吸光度的RSD為 0.8%，表明精密度良好。

2.2.5 回收率試驗 取處理1的當歸樣品粉末共9份，每份稱定約1 g，分為3組，各組分別加入葡萄糖對照品5.0、8.0、10.0 mg，進行測定，得當歸多糖的平均回收率分別為98.37%、96.02%、98.97%，RSD為1.72%。

2.2.6 樣品測定 取各當歸樣品，制備供試品溶液并測定，結果見表3。

由表3可知，不同施肥處理下當歸多糖含量為處理2>處理4>處理1>處理3。處理2比不施肥當歸多糖含量增加了5.62%，但各處理間沒有顯著性差異。

2.3 HPLC測定當歸中7種化學成分的含量

2.3.1 線性關系考察 吸取“1.5.3”節混合對照品溶液，按照一定濃度梯度稀釋成6個不同濃度的混合標準品溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾后按照“1.5.3”節色譜條件進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），對照品進樣濃度為橫坐標（X）進行線性回歸分析，回歸方程及線性范圍結果見表4。

2.3.2 重復性試驗 稱取6份處理1的當歸粉末，每份0.5 g，按照“1.5.3”節方法制備供試品溶液，并在色譜條件下進行測定，計算其峰面積，結果按照出峰時間先后順序阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、藁本內酯、歐當歸內酯含量的RSD（n=6）依次為3.45%、3.24%、4.64%、0.62%、3.32%、3.83%、1.09%。RSD值均小于5%。說明本方法重復性良好。

2.3.3 精密度試驗 取一份混合對照品溶液，按照“1.5.3”節的色譜條件，連續不間斷進樣測定6次，考察儀器精密度。結果阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、藁本內酯、歐當歸內酯的精密度RSD（n=6）分別為4.09%、1.06%、3.70%、1.82%、0.54%、0.47%、0.55%。RSD值均小于5%。說明該儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 吸取“1.5.3”節下混合對照品溶液，按照色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h測定，記錄各成分峰面積。各成分峰面積RSD（n=6）值分別為4.97%、2.93%、0.70%、0.16%、1.17%、0.09%、2.06%。RSD值均小于5%。說明該供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.5 加樣回收率測定 稱取已知含量的6份當歸粉末0.5 g，分別加入一定量的阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、藁本內酯、歐當歸內酯。按“1.5.3”節方法制備供試品溶液，按照色譜條件測定，計算出7種化學成分的加樣回收率，分別是97.49%、100.31%、101.57%、98.27%、101.66%、97.01%和97.45%。RSD分別是3.77%、1.28%、0.65%、1.81%、0.32%、0.48%和0.39%，說明該測定方法的準確性較好。

2.3.6 樣品測定 由表5和圖2可知，不同施肥處理對當歸中7種藥效成分含量均有顯著影響，單施有機肥有助于當歸中阿魏酸和藁本內酯的積累，生物有機肥+復合肥處理下當歸中阿魏酸的含量較不施肥處理增加了98.3%。與單施有機肥、生物有機肥+復合肥相比，單施復合肥對當歸中洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯和歐當歸內酯的積累有促進作用。

2.3.7 主成分分析 （1）相關性分析。運用 SPSS 21.0 統計分析軟件，對4個不同施肥處理當歸藥材中7種化學成分進行主成分分析，結果見表6、表7。提取標準為特征值大于1，前2個成分的累積方差貢獻率達到 95.446%，前2個成分可以代表當歸藥材中的絕大部分信息。根據表7，第1主成分的信息主要由歐當歸內酯、洋川芎內酯H、阿魏酸松柏酯和洋川芎內酯I組成，第2主成分主要由阿魏酸、洋川芎內酯A和藁本內酯組成。（2）不同施肥處理的當歸藥材有效成分含量的綜合評價。根據表8得到因子得分表達式：W1=-0.173X阿魏酸+0.168X洋川芎內酯I+0.175X洋川芎內酯H+0.168X阿魏酸松柏酯+0.155X洋川芎內酯A-0.070X藁本內酯+0.175X歐當歸內酯;W2=0.030X阿魏酸-0.217X洋川芎內酯I+0.093X洋川芎內酯H+0.118X阿魏酸松柏酯+0.330X洋川芎內酯A+0.889X藁本內酯+0.093X歐當歸內酯。

式中：X為各成分的含量，方差貢獻率為權重。以2個主成分對當歸藥材進行綜合評價，計算其綜合評價的函數為W=80.851F1+14.595F2，并對結果進行排序，綜合得分排序結果見表9。從當歸藥效成分積累角度看，單施復合肥的當歸質量最好，其次為單施有機肥。不施肥和有機肥+復合肥質量排名靠后。

3 結論與討論

3.1 不同施肥處理對當歸藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量的影響

從表2可以看出，各施肥處理下當歸藥材的水分均小于15.0%，總灰分小于7.0%，酸不溶性灰分小于2.0%，浸出物含量均超過45.0%，均達到2020年版《中華人民共和國藥典》標準。中藥材中含水量過高會容易出現蟲害、霉變、潮解、走味等變質現象，直接影響藥材的質量。本試驗結果表明，當歸水分含量在處理1顯著低于其他處理。從藥材中的灰分含量可以直觀地看出藥材的純度，藥材生長環境、種植方式等會影響藥材灰分變化，本研究不同施肥處理下藥材總灰分含量均為處理2顯著低于其他處理，酸不溶性灰分含量也是處理2最低。研究證明，藥材中醇溶性浸出物含量和藥效成分含量具有一定的正相關性，浸出物可反映藥材的內在品質，在處理1和處理2下浸出物含量高于其他處理。由此說明，增施有機肥可降低藥材水分、灰分、酸不溶性灰分含量，提高醇溶性浸出物含量。

3.2 不同施肥處理對當歸多糖含量的影響

當歸多糖具有造血、抗腫瘤、抗氧化、增強免疫能力等豐富的生理功效[8]。本試驗結果表明，不同施肥處理下當歸多糖含量大小為處理2>處理4>處理1>處理3。但各處理之間當歸多糖含量并無顯著性差異。

3.3 利用主成分分析法評價不同施肥處理對當歸中7種化學成分含量的影響

據研究，阿魏酸、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯類化合物、藁本內酯和歐當歸內酯在諸多方面均具有良好的藥理活性[9-11]。阿魏酸是2020 年版《中華人民共和國藥典》中當歸的指標性成分。故本研究采用HPLC同時測定當歸中阿魏酸、洋川芎內酯 I、洋川芎內酯 H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、藁本內酯和歐當歸內酯 7 種成分。以往的研究學者在中藥質量評價時大多對指標進行逐一分析，各指標權重和成分之間的聯系并不明確，而主成分分析法恰好可以彌補上述問題[12]。主成分分析結果表明，從7種有效成分含量的角度看，單施復合肥和單施有機肥可促進當歸有效成分的提高。因為復合肥中的總養分較高（≥51%）且施用量較大，所以可提高當歸中藥效成分含量。若長期大量施用化肥，必然會造成土壤的肥力減弱，地力下降，土壤的理化性質退化，以及會導致土壤鹽漬化、病蟲害發生嚴重等一些其他問題的出現。施用有機肥可使土壤養分含量更全面，肥效更穩定和持久，對有效成分含量積累也有一定的促進作用。

綜上所述，不同施肥處理對當歸藥材品質均有一定影響。本研究中，當歸的最佳施肥條件為單施有機肥4797.6 kg/hm2，由于不同施肥處理對當歸中不同藥效成分的積累能產生不同影響，市面上常見以阿魏酸、藁本內酯或洋川芎內酯為主要成分的各類藥物、護膚品等，可針對不同需求結合本研究結果按需施肥。

參考文獻：

[1]中華人民共和國國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[S]. 北京：中國醫藥科技出版社，2015：133-134.

[2]趙銳明，陳 垣，郭鳳霞，等. 甘肅岷縣野生當歸資源分布特點及其與栽培當歸生長特性的比較研究[J]. 草業學報，2014，23（2）：29-37.

[3]孫紅梅. 當歸藥材資源調查與品質特征的研究[D]. 北京：中國協和醫科大學，2010.

[4]丁丹丹，李西文，陳士林，等. 優質中藥材栽培合理施肥探討[J]. 世界科學技術-中醫藥現代化，2018，20（7）：1114-1122.

[5]曹顏冬. 當歸化學成分及藥理作用的分析[J]. 世界最新醫學信息文摘，2019，19（2）：93，95.

[6]李 曦，張麗宏，王曉曉，等. 當歸化學成分及藥理作用研究進展[J]. 中藥材，2013，36（6）：1023-1028.

[7]呂潔麗，陳紅麗，段金廒，等. 不同加工方法對當歸多糖的影響[J]. 中國中藥雜志，2011，36（7）：846-849.

[8]王利華，王菲菲，劉 悅，等. 當歸多糖的研究進展[J]. 天津藥學，2017，29（3）：67-70.

[9]左愛華，王 莉，肖紅斌. 藁本內酯藥理學和藥代動力學研究進展[J]. 中國中藥雜志，2012，37（22）：3350-3353.

[10]李韶菁，張迎春，蘇培瑜，等. 阿魏酸松柏酯的研究進展[J]. 中國實驗方劑學雜志，2011，17（3）：229-231.

[11]張艷花. 歐當歸內酯A誘導結腸癌細胞調亡的作用及機制研究[D]. 太原：山西大學，2019.

[12]楊明星，石學敏. 試論主成分分析在中藥研究中的應用[J]. 遼寧中醫雜志，2008，35（8）：1219-1221.