響應面法優化乳酸乳球菌Z103菌株產抑菌物質的發酵條件

杜琨

摘要：以分離于高原酸奶中的乳酸菌Z103為研究對象，通過單因素試驗確定蔗糖、大豆蛋白胨、酵母浸膏、MgSO4、NaCl、牛肉膏、Na2HPO4、（NH4）2SO4、裝液量、接種量、發酵溫度和pH值對產抑菌物質活力的影響，應用響應面法的Box-Behnken設計對產抑菌物質發酵條件進行優化。結果表明，當發酵液pH 值7.0、裝液量40 mL、大豆蛋白胨含量 9.6 g/L 時可獲得抑菌物質最大抑菌圈直徑為1.350 cm，優化后乳酸菌產抑菌物質的效價較優化前提高了41.17%。該模型能科學地預測抑菌物質的合成情況。響應面法可有效、成功地優化抑菌物質的發酵條件。

關鍵詞：抑菌物質;乳酸乳球菌;響應面法;發酵條件;優化

中圖分類號：S182 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）10-0155-07

從高原酸奶中分離出產抑菌物質的乳酸菌，經過發酵條件的優化，生產出活性高、抑菌普廣的抑菌物質，該種抑菌物質有廣闊的發展前景，主要原因在于：抑菌活性高，比nisin的抑菌活性高得多;成本低，安全性高;來源廣泛。因此，從高原酸奶中生產抑菌物質的研究備受國內外研究人員的關注。

PB試驗設計（Plackett-Burman design）是一種經濟有效的二水平試驗設計方法[1-3]，它可以從眾多考察因素中快速有效地篩選出主要的影響因素[4-7]。響應面法（response surface methodology，RSM）是一種優化生物過程的綜合技術，可同時對影響生物產量的因子水平及交互作用進行優化與評價[8-11]，快速有效地確定多因子系統的最佳條件，該法已被廣泛應用于培養基和培養條件的優化[12]、提取技術和酶學性質的研究[13-16]、異黃酮[17-18]及藥物的作用[19-20]等研究方面。利用JMP（Version 4.0.5，SAS Institute Inc.，1989—2001）實驗設計軟件對影響乳酸菌產抑菌物質產量的各方面因素進行優化研究，篩選出主要影響因子。在此基礎上，借助Box-Behnken試驗設計，對主要影響因子的最佳水平及其交互作用做進一步研究，以期獲得較高產量的乳酸菌產抑菌物質。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生產菌：乳酸乳球菌Z103菌株，由西藏高原酸奶中分離得出。 ?檢測指示菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由陜西師范大學食品工程與營養科學學院微生物實驗室提供。該試驗于2018年12月在陜西師范大學食品工程與營養科學學院微生物實驗室開展。

1.2 主要試劑

蔗糖、酵母浸膏、MgSO4·7H2O、NaCl 、牛肉膏、大豆蛋白胨、Na2HPO4·12H2O、（NH4）2SO4、KH2PO4、亮氨酸等試劑均為國產。

1.3 培養基

種子培養基：1%大豆蛋白胨、1%酵母浸膏、0.5%NaCl、0.05%MgSO4·7H2O、0.034%亮氨酸、0.5%蔗糖、pH值6.8。

活化培養基：在種子培養基中加入1.5%瓊脂。

發酵培養基：20 g/L蔗糖、10 g/L大豆蛋白胨、10 g/L酵母浸膏、10 g/L牛肉膏 、0.4 g/L MgSO4·7H2O、5 g/L NaCl、18 g/L Na2HPO4 ·12H2O、12 g/L （NH4）2SO4。

發酵液效價檢測培養基：1%酵母浸膏、1%大豆蛋白胨、0.5% NaCl、pH值7.0。

1.4 主要儀器與設備

TQHZ-2002A恒溫振蕩培養箱，太倉市華美生化儀器廠;GHP-250恒溫培養箱，揚州市三發電子有限公司;SB-3S-1無菌操作臺，上海博迅實業有限公司醫療設備廠;XY280B不銹鋼蒸汽消毒器，上海三申醫療器械有限公司;GL-20G-Ⅱ冷凍離心機，上海安亭儀器設備有限公司;GHP-250智能光照培養箱，揚州市三發電子有限公司。

1.5 試驗方法

1.5. 菌種活化 將保藏的乳酸菌和金黃色葡萄球菌斜面菌種轉接至各自的活化培養基，分別于30 ℃和37 ℃培養18 h，使菌體恢復生理活性。

1.5.2 種子瓶培養 以2%的接種量將培養了 18 h 的Z103菌株轉接入種子培養液中，于30 ℃ 150 r/min 的培養條件下培養18 h備用。

1.5.3 發酵培養 依照試驗設計配制發酵培養基，將種子液按設計接種量分別接種于不同的處理中，按設計溫度置于恒溫振蕩培養箱中150 r/min培養24 h。

1.5.4 乳酸菌產抑菌物質抑菌活性測定方法 將供試菌種接種培養（37 ℃培養24 h）后，用血細胞計數板對活化好的菌液進行計數，用無菌水將菌液濃度調至106 CFU/mL。用改進濾紙片法測量抑菌圈大小。

1.5.5 試驗設計

1.5.5.1 主成分分析 在單因素基礎上對乳酸菌產抑菌物質發酵培養基進行主成分設計，降維篩選出影響顯著的前3個因子，最終再結合響應面設計確定最佳發酵培養基配方。主成分試驗設計水平見表1，設計方案及結果見表2。

1.5.5.2 響應面分析 試驗選取通過降維分析得到的3個因子作為響應因子，見圖1，以發酵清液抑菌圈直徑作為響應值（Y1），通過Box-Behnken Design進一步進行優化。試驗方案及結果見表3。

1.5.6 模型驗證試驗 根據試驗結果選擇最理想的5組發酵條件進行驗證試驗，并進行相關距離分析，驗證產生高原乳酸菌素模型的有效性。

2 結果與分析

2.1 Z103菌株發酵培養條件關鍵因子的確定

對表2的結果進行分析，建立Z103菌株代謝產量初步回歸模型：

Y1=1.374 375-0.016 875x1+0.030 625x2-0.010 625x3+0.011 875x4+0.006 875x5+0.005 625x6+0.000 625x7+0.029 375x8-0.038 125x9-0.004 375x10+0.013 125x11+0.106875x12。（1）

由式（1）可知，乳酸菌產抑菌物質代謝產量與蔗糖含量、酵母浸膏含量、裝液量和接種量呈負相關，而與其余響應因子均呈正相關。由表4方差分析看出，誤差項不顯著，而多元回歸系數R2=0.953 7，說明回歸方程（1）能夠在95.37%的置信度上解釋響應因子對響應值的影響，試驗數據與所采用的二次數學模型基本符合，模型與實際情況擬合程度較好，可用于對乳酸菌產抑菌物質代謝產量影響的預測，具有實際應用意義。

由方差分析表還可知，響應因子對乳酸菌產抑菌物質代謝產量影響的順序為x12>x9>x2>x8>x1>x11>x4>x3>x5>x6>x10>x7，即pH值>裝液量>大豆蛋白胨含量>（NH4）2SO4含量>蔗糖含量>發酵溫度>MgSO4·7H2O含量>酵母浸膏含量>NaCl含量>KH2PO4添加量>接種量>Na2HPO4·12H2O含量。其中最重要的3個因素為發酵液pH值、裝液量和大豆蛋白胨含量。用此3個因子再做響應面設計，以確定最佳發酵條件。

2.2 響應面法優化Z103菌株發酵條件

2.2.1 預測模型的建立及回歸分析檢驗 利用SAS 9.2 統計軟件對表3中響應值進行多元回歸擬合，獲得關于編碼自變量pH值、裝液量和大豆蛋白胨含量的二次多項回歸方程：

Y1=1.278 69-0.024 923x1-0.028 395x2-0.016 052x3+0.002 178x21-0.022 063x1x2-0.023 528x1x3+0.0377 82x22+0.011 91x2x3-0.025 396x23。（2）

由表5方差分析可知， 本試驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性（P=0.014 1<0.05）;失擬項P值（0.373 0）較大，表明相對于純誤差而言，失擬項不顯著，多元擬合系數R2=0.939 9，表明僅有6.01%的Z103菌株代謝產量總變異不能由此模型進行解釋，其實際值與預測值之間具有較好的擬合程度，可以用該方程對不同發酵條件下的響應值進行預測。

由表5還可以看出，發酵液pH值和裝液量的一次項、裝液量和大豆蛋白胨含量的二次項均具有極顯著性;大豆蛋白胨含量的一次項、發酵液pH值和裝液量的交互項以及發酵液pH值和大豆蛋白胨含量的交互項顯著。對回歸系數進行檢驗， 表明發酵液pH值和裝液量的二次項以及裝液量和大豆蛋白胨含量的交互項對Z103菌株代謝產量影響呈正效應，其余各因子對其影響為負效應，回歸模型的F值為8.695 478，P等于0.014 1，說明模型的回歸效果顯著具有實際應用意義。剔除二次回歸方程中不顯著項，優化后的回歸模型方程為

Y=1.278 69-0.024 923x1-0.028 395x2-0.016 052x3+0.037 782x22-0.025 396x23-0.022 063x1x2-0.023 528x1x3。（2）

2.2.2 Z103菌株代謝產量響應面分析與優化 由圖2見，固定大豆蛋白胨含量為零水平，當發酵液pH值不變且處于較低水平時，隨著裝液量的升高響應值呈開口向上的拋物線;而發酵液pH值處于較高水平時，隨著裝液量水平增加，響應值幾乎呈線性下降，之后略有上升。當固定裝液量不變且處于較低水平時，隨著發酵液pH值升高響應值有小幅增加，二者呈線性變化;當固定裝液量不變且處于較高水平時，隨著發酵液pH值的升高響應值呈線性下降，且變化幅度較大。從發酵液pH值和裝液量交互作用的等高線圖（圖2右）可以看出，響應值對裝液量的變化更為敏感。這也進一步驗證了響應面圖分析的正確性。

由圖3可見，固定裝液量為零水平，當發酵液pH值不變且處于較低水平時，隨著大豆蛋白胨含量的升高響應值迅速增加，之后略有下降;而當發酵液pH值不變且處于較高水平時，隨著大豆蛋白胨含量的增加，響應值先略有上升，之后迅速下降。當固定大豆蛋白胨含量不變且處于較低水平時，響應值隨發酵液pH值變化趨勢不明顯;當固定大豆蛋白胨含量不變且處于較高水平時，隨著發酵液pH值的升高響應值則呈線性下降，且變化幅度較大。從發酵液pH值和大豆蛋白胨含量交互作用的等高線圖（圖3右）可以看出，響應值對大豆蛋白胨含量的變化更為敏感。

由以上響應面圖可知，發酵液pH值、裝液量和大豆蛋白胨含量三者之間的交互作用出現鞍面，無極值的存在，說明不能從二次響應面上找出最佳參數，需進一步做嶺脊分析，見表6。

利用SAS 9.2進行分析，得到回歸模型存在穩定點，當編碼半徑為1.0時響應值Y（即抑菌圈直徑）最大，約為1.347 36，此時優化參數為發酵液pH值7.0，裝液量40 mL，大豆蛋白胨含量9.6 g/L。

2.3 回歸模型驗證試驗

通過上述回歸模型，采用SAS 9.2軟件優化發酵條件，獲得Z103菌株的最適發酵條件為發酵液pH值 7.0，裝液量40 mL，大豆蛋白胨含量9.6 g/L，在此條件下抑菌圈直徑可達到1.347 36 cm。采用上述條件進行驗證試驗，結果獲得的抑菌圈直徑為1.350 cm，與預測值的相對誤差為0.48%;并且未進行發酵條件優化時，乳酸菌產抑菌物質的效價為850.26 IU/mL，優化后抑菌物質的效價達到 1 200.32 IU/mL，較優化前提高了41.17%。證明采用響應面法對乳酸菌產抑菌物質產生菌進行發酵培養基優化準確可靠，具有實用價值和指導意義。

3 討論與結論

Z103菌株的代謝產物受發酵條件的影響很大，因此，對Z103菌株發酵培養基和外在條件進行優化研究十分必要。孫帥等都利用單因子和正交試驗對發酵條件進行過研究[21-24]。Sen等采用響應曲面法對脂肽surfactin發酵條件進行了優化研究[25-26]。但這些研究主要是針對乳桿菌產生的細菌素發酵條件的研究，對從高原酸奶中提取能產生抑菌物質的Z103菌株的發酵條件和發酵培養基方面的研究報道較少。

本試驗采用PB試驗設計和響應曲面法對培養條件進行了優化。PB試驗設計法是一種經濟有效的二水平試驗設計方法，它的主因素為正交設計，兩因素之間的交互作用僅部分與主因素產生混淆。響應曲面法是一種優化生物技術過程的綜合技術方法，它可以建立連續變量曲面模型，對影響生物過程的因素水平及其交互作用進行優化與評價，可快速確定多因子的最佳條件[27]。與傳統方法相比，響應曲面法試驗次數少，節省人力物力，已被廣泛應用于培養基優化的實踐中。

PB試驗設計省時省力，可快速有效地從諸多相關因素中篩選出主要影響的內在因素和外部因素，在此基礎上，通過響應曲面法建立數學模型，利用優化后的發酵條件產生的抑菌物質效價較原來提高了41.17%。

通過PB試驗設計對主成分的分析，優選出對Z103菌株代謝產量有主要影響的3個因子為發酵液pH值、裝液量和大豆蛋白胨含量。

失擬項P值較大，表明相對于純誤差而言，失擬項不顯著，多元擬合系數R2=0.939 9，表明僅有6.01%的Z103菌株發酵產物總變異不能由此模型進行解釋，其實際值與預測值之間具有較好的擬合程度，可以用該方程對不同發酵條件下的響應值進行預測。

由嶺脊分析結果得出Z103菌株最佳發酵產抑菌物質的發酵條件為發酵液pH值7.0，裝液量為40 mL，大豆蛋白胨含量為9.6 g/L。

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