鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發酵乳在非酒精性脂肪肝細胞模型中對人肝細胞L-02的益生作用

陳大衛,梁嬌嬌,程月,瞿恒賢,陳春萌,任晨瑜,張臣臣,關成冉,馬文龍,陳霞,李啟明,顧瑞霞*

1(揚州大學 食品科學與工程學院 江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室,江蘇 揚州,225127) 2 (新希望乳業股份有限公司,四川 成都,610023)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是由非酒精消耗或其他原因引起的肝臟脂質過量,造成肝細胞中脂滴積聚,肝臟呈現腫大的現象,會對人體健康產生較大的影響[1]。目前,NAFLD的藥物治療主要是通過預防肝細胞的氧化、減少肝細胞的促炎因子及血脂水平等方式進行[2-3],但其存在一定的副作用[4]。通過膳食干預也能有效改善肝臟的脂肪變性和炎癥反應,并具有良好的益生作用[5],因此,膳食干預是人們進行輔助治療NAFLD的重要途徑。

益生菌及其發酵乳制品不僅可以通過調節腸道微生態平衡等來增強機體的抗氧化能力和免疫能力[6-7],還可以通過降低肝細胞的甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)含量以及調節脂肪變性和炎癥因子水平等來改善機體的NAFLD癥狀[8-10]。而臨床研究也發現,益生菌可以通過改善患者血清中的天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平及降低脂肪肝指數等來達到輔助治療NAFLD的效果[11-14],但具體的作用機制尚不明確。

目前,NAFLD的機制研究大多數采用動物和肝癌細胞株HepG2來進行[15],但動物模型造模周期長、成本高、穩定性較差；同時,肝癌細胞株HepG2與人肝細胞存在較大的差距[16]。與之相比,人肝細胞系L-02具有造模周期短、個體差異小等優勢[17]。來源于廣西巴馬長壽人群的鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301發酵乳對由高血脂癥引起的大鼠肝臟細胞脂肪變性具有良好的改善作用[18],但對于人肝細胞的作用效應和機制尚不明確。研究顯示,將樣品在大鼠體內經過一系列的生物轉化,再作用于細胞的研究結果較樣品直接添加到細胞中更為準確[19]。本文利用油酸和棕櫚酸的混合物游離脂肪酸(free fat acid,FFA)建立體外人肝細胞L-02 NAFLD模型,探討鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301發酵乳干預大鼠后的血清在模型中對脂肪變性的人肝細胞L-02的益生作用,并建立一種更接近于人肝細胞的體外NAFLD細胞變性模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Wistar雄性大鼠,6周齡,體重(200±20) g,揚州大學比較醫學中心,動物生產許可證號SCXK(蘇)2017-0007,實驗動物使用許可證號SYXK(蘇)2017-0044；基礎飼料(面粉、米粉、玉米、鼓皮、豆料、魚粉及骨粉的質量分數分別為20%、10%、20%、26%、20%、2%、2%),江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司；鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)hsryfm 1301,江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室；人肝細胞株L-02,蘇州北納創聯生物技術有限公司。

胎牛血清,杭州四季青生物有限公司；RPMI-1640培養液,美國Hyclone公司；無脂肪酸牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),德國Ruibio公司；細胞凍存液、胰酶消化液(質量分數為0.25%)、RIPA裂解液,上海碧云天生物技術有限公司；油酸鈉(oleic acid,OA)、油紅O試劑盒、AV/PI凋亡試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司；棕櫚酸鈉,美國Sigma公司；CCK8(Cell Counting Kit-8)細胞增殖-毒性檢測試劑盒,日本同仁公司；甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)試劑盒,美康生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HERAcell 150CO2培養箱、Multiskan Sky 1510全波長酶標儀,美國ThermoFisher科技有限公司；IX2-ILL100熒光倒置顯微鏡,日本Olympus公司；7020全自動生化分析儀,日本日立公司；5804R高速冷凍離心機,德國Eppendorf股份公司；LSRFortessa流式細胞儀,美國BD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞培養

將復蘇的人肝細胞L-02置于完全培養液中(RPMI-1640培養液和胎牛血清的體積分數分別為90% 和10%),于37 ℃,體積分數為5% CO2的培養箱中培養,每24 h更換1次培養液,待細胞生長至對數期時(細胞面積>80%),用胰酶消化液消化傳代,取5代后的細胞進行后續試驗。

1.3.2 NAFLD細胞模型中FFA的添加濃度

1.3.2.1 不同FFA濃度對細胞存活率的影響

取100 μL濃度為5×104個/mL的人肝細胞L-02懸液接種于96孔培養板中,在37 ℃,體積分數為5% CO2的培養箱中培養24 h后棄去培養液；利用含質量分數為1%的BSA完全培養液將5 mmol/L FFA分別稀釋至0、0.25、0.5、0.75、1、1.5和2 mmol/L；以未添加FFA為對照組,添加不同濃度的FFA為模型組,每組3個復孔,CO2培養箱培養24 h后加入10 μL CCK8試劑,37 ℃孵育1 h后于490 nm處測定OD值,按公式(1)計算細胞存活率：

(1)

1.3.2.2 不同FFA濃度對細胞脂滴的影響

取1 mL濃度為5×105個/mL的人肝細胞L-02懸液接種于6孔培養板中,在37 ℃,體積分數為5% CO2的培養箱中培養24 h后棄去培養液,以未添加FFA為對照組,添加1.3.2.1小節中不同濃度的FFA為模型組,每組3個復孔,CO2培養箱培養24 h后,釆用油紅O染色法觀察細胞內脂滴變化情況。

1.3.3 NAFLD細胞模型的評價

1.3.3.1 細胞內TG、TC含量的測定

取1 mL濃度為5×105個/mL的人肝細胞L-02懸液接種于6孔培養板中,以不添加FFA為對照組,添加最佳濃度的FFA為模型組,每組3個復孔,在37 ℃,體積分數為5% CO2的培養箱中培養24 h后棄去培養液,胰酶消化液消化3 min后,用完全培養液終止消化,1 000×g離心5 min,PBS溶液清洗2遍,每管加入1 mL RIPA細胞裂解液,吹打均勻,置于冰上裂解4 h后,12 000×g離心10 min取上清液,采用全自動生化分析儀測定上清液中TG和TC含量。

1.3.3.2 細胞培養液中AST、ALT酶活力的測定

從1.3.3.1小節培養24 h后的6孔培養板中取出細胞上清液,以不添加FFA為對照組,4 000×g離心5 min,測定培養液中AST和ALT的含量。

1.3.3.3 細胞凋亡率的測定

取1 mL濃度為5×106個/mL的人肝細胞L-02懸液接種于6孔培養板中,在37 ℃,體積分數為5% CO2的培養箱中培養24 h,對照組加入含1%的BSA的完全培養液,模型組加入最佳濃度的FFA,每組3個復孔,培養24 h后加入500 μL胰酶消化液消化3 min后,加入完全培養液終止消化,1 000×g離心5 min,去上清液收集細胞；用100 μL 1×buffer輕輕吹打細胞后,分別加入4 μL 異硫氰酸熒光素和4 μL 碘化丙啶,輕輕渦旋混勻,室溫避光孵育15 min后每管加入400 μL 1×buffer,混勻,測定細胞凋亡率。

1.3.4 鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301發酵乳的制備

將在MRS液體培養基中活化2代后的鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301按3%的接種量接種至熱處理后質量分數為12%的脫脂乳中,42 ℃發酵至活菌數為109CFU/mL,進行活菌計數,4 ℃貯藏備用。

1.3.5 大鼠血清的制備

試驗期間保持動物房通風、透光,室溫為(23±1) ℃,濕度為(50±5)%,22只Wistar雄性大鼠用基礎飼料正常飼喂1周后,按各組間平均體重無顯著差異分為對照組和益生菌干預組,每組11只。干預組喂食基礎飼料,并按1 mL/100 g的量灌胃鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發酵乳,對照組喂食基礎飼料及等量的質量分數為0.9%的生理鹽水,每天上午灌胃1次,記錄每天的進食量及每周的體重,以便調整灌胃量。4周后眼球取血,4 ℃孵育30 min,3 500×g離心20 min,合并同組大鼠血清,56 ℃滅活30 min除去血清中的雜抗體等物質,并利用0.22 μm濾孔過濾除菌,避免細胞受到污染[17,20],-80 ℃保存備用。所有實驗程序嚴格按照《實驗動物的護理和使用指南》進行。

1.3.6 鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301發酵乳干預后的大鼠血清對模型中細胞的益生作用

利用RPMI-1640培養液分別將對照組和干預組的大鼠血清稀釋至10%[17],然后取1 mL 加至細胞模型中,每組3個復孔,于37 ℃,體積分數為5% CO2的培養箱中培養24 h,PBS溶液清洗2遍；觀察各組細胞內脂滴的變化,并測定細胞中TG、TC含量、細胞凋亡率以及血清細胞培養液中AST和ALT的含量。

1.4 數據處理與分析

數據均采用Sigmaplot 10.0、SPSS 21.0軟件進行統計和分析,結果以均值±標準差(Mean±SD)表示,以單因素方差分析進行顯著性檢驗,P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 NAFLD細胞模型中FFA的添加濃度

通過測定模型中人肝細胞L-02的存活率及觀察細胞內脂滴變化情況來確定模型中FFA的最佳添加濃度,結果如表1和圖1所示。

表1 不同濃度的FFA對細胞存活率的影響(n=3)Table 1 Effect of different concentration of FFA on the survival rate of cells

a-0 mmol/L (對照組)；b-0.25 mmol/L；c-0.5 mmol/L；d-0.75 mmol/L；e-1 mmol/L；f-1.5 mmol/L；g-2 mmol/L圖1 不同濃度的FFA對細胞脂滴的影響(×400)Fig.1 The effect of different concentration of FFA on the lipid droplets in cells

由表1可知,當模型中FFA的濃度分別為0.25、0.50和0.75 mmol/L時,人肝細胞L-02的存活率較高,均大于88.78%；而隨著FFA濃度的不斷增加,細胞的存活率隨之下降,當FFA濃度大于1 mmol/L時,細胞的存活率顯著下降(P<0.05),由1 mmol/L時的86.37%分別下降至1.5 mmol/L時的31.98%和2 mmol/L時的19.48%。

由圖1可知,人肝細胞L-02經油紅O染色后,未添加FFA的細胞邊緣清晰,核膜完整,細胞內未見紅色脂滴；而隨著FFA濃度的增加,細胞內脂滴數量呈逐漸增多,且體積呈逐漸增大的趨勢。當FFA濃度大于1 mmol/L時,肉眼可見的細胞數量大幅度減少,細胞形狀發生變化,表明當添加的FFA超過一定濃度時,會嚴重損傷細胞；但當濃度低于1 mmol/L時,脂肪變性不充分,脂滴數量較少；當FFA濃度為1 mmol/L時,細胞脂肪變性充分,脂滴數量較多,結合細胞存活率的試驗結果,選取1 mmol/L作為模型中FFA的最佳添加濃度。

2.2 NAFLD細胞模型

由表2可知,添加了1 mmol/L FFA的模型組人肝細胞L-02培養24 h后,細胞內TG含量為5.73 mmol/L,顯著高于對照組(P<0.05)；同時,培養液中AST含量為113.50 U/L,顯著高于對照組的73.67 U/L(P<0.05),表明1 mmol/L的FFA造成了細胞的脂肪變性,與NAFLD大鼠模型特征較為一致[21]。

表2 脂肪變性細胞內TG、TC及細胞培養液中 AST和ALT 的含量(n=3)Table 2 Content of TG,TC in the steatosis cells and AST,ALT content in the cell culture medium

由圖2可知,對照組人肝細胞L-02的早期凋亡率為1.82%,晚期凋亡率為1.79%,占總體細胞的3.61%；而模型組細胞早期凋亡率為1.88%,晚期凋亡率為2.14%,占總體細胞的4.02%,兩組之間的細胞凋亡率差異較小,表明1 mmol/L的FFA對細胞未造成嚴重損傷,與機體單純性脂肪變性特征相符[22]。

a-對照組；b-模型組圖2 脂肪變性對細胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of steatosis on the apoptosis rate of cells

2.3 鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發酵乳干預后的大鼠血清對模型中細胞的益生作用

2.3.1 大鼠血清對細胞脂滴的影響

以未干預菌株發酵乳的大鼠血清作為對照組,研究鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發酵乳干預后的大鼠血清對NAFLD模型中人肝細胞L-02脂滴的影響,結果如圖3所示。

a-對照組；b-益生菌干預組圖3 大鼠血清對細胞脂滴的影響(×400)Fig.3 Effect of rats serum on the lipid droplets in cells

由圖3可知,對照組大鼠血清作用脂肪變性的人肝細胞L-02 24 h后,細胞邊緣較為明顯,核膜完整,胞內出現紅色脂滴且體積較大,出現脂肪變性現象；與對照組相比,干預組大鼠血清作用的細胞內胞漿豐富,胞內紅色脂滴數量較少、體積較小,表明鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發酵乳干預的大鼠血清能有效改善細胞的脂肪變性。

2.3.2 大鼠血清對細胞TG、TC含量及血清培養液中AST和ALT含量的影響

鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發酵乳干預后的大鼠血清對模型中人肝細胞L-02 胞內TG、TC含量的影響及血清培養液中AST和ALT的含量見圖4和圖5。

圖4 大鼠血清對細胞TG和TC含量的影響(n=3)Fig.4 The effect of rats serum on the content of TG and TC in cells

圖5 大鼠血清細胞培養液中AST和ALT的含量(n=3)Fig.5 The content of AST and ALT in the cell culture medium of rats serum

由圖4可知,干預組的大鼠血清作用于人肝細胞L-02后,細胞內TG含量為1.95 mmol/L,顯著低于對照組的2.88 mmol/L(P<0.05)；TC含量稍低于對照組,但無顯著性差異(P>0.05)。

由圖5可知,對照組的人肝細胞L-02培養液中AST的含量為118.67 U/L,干預組的血清細胞培養液中AST的含量為93.33 U/L,顯著低于對照組(P<0.05)；而ALT的含量分別為5.59 U/L和5.83 U/L,無顯著性差異(P>0.05)；表明鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發酵乳可通過降低細胞內TG和AST轉氨酶的含量來減輕NAFLD對細胞的損傷。

2.3.3 大鼠血清對細胞凋亡率的影響

鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發酵乳干預后的大鼠血清對人肝細胞L-02凋亡率的影響如圖6所示。

a-對照組；b-益生菌干預組圖6 大鼠血清對細胞凋亡率的影響Fig.6 The effect of rats serum on the apoptosis rate of cells

由圖6可知,對照組中人肝細胞L-02的早期凋亡率為1.42%,晚期凋亡率為5.04%,正常細胞數量為91.2%；經干預組的大鼠血清作用后,人肝細胞L-02的早期凋亡率為0.89%,晚期凋亡率為2.61%,正常細胞數量高達95.7%。與對照組相比,干預組的細胞凋亡率相對下調了2.96%,正常細胞數量相對上調了4.5%,說明鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發酵乳干預的大鼠血清能夠降低人肝細胞L-02的凋亡率,緩解細胞損傷,對NAFLD具有較好的改善作用。

3 討論

由于人與動物之間生物代謝表達和活性不同[23],使得在動物試驗中肝細胞脂肪變性的穩定性較差[14],因此建立一種理想的體外模擬人肝細胞的NAFLD模型尤為重要。棕櫚酸是飲食和血清中最豐富的游離脂肪酸,容易引發肝臟的脂肪變性[24-25],而油酸毒性較小,能夠抵消棕櫚酸對肝細胞的毒性[26],并具有增強棕櫚酸酯化和穩定脂滴的能力[27]。因此,試驗采用油酸和棕櫚酸混合的FFA建立人肝細胞L-02脂肪變性模型。當1 mmol/L的FFA作用于人肝細胞L-02時,對細胞的存活率影響較小,同時還使得細胞內脂滴數量達到最大值,并顯著增加了模型中細胞TG含量及培養液中AST含量(P<0.05),且細胞的凋亡率與對照組無顯著性差異(P>0.05),符合NAFLD的特征指標[21]。表明成功建立的NAFLD細胞模型,具有造模周期短、穩定性好等優勢[28]。

鼠李糖乳桿菌可以通過調節腸道微生物來改善機體的NAFLD癥狀[29]。鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301發酵乳能夠通過調節與脂質代謝相關的腸道微生物來改善大鼠血清的脂質代謝[18],而本文的研究還發現,鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發酵乳干預后的大鼠血清不僅可以顯著降低細胞TG含量,還可以顯著降低細胞培養液中AST的含量(P<0.05)；CAUSSY等[30]的研究發現,血清中來自腸道微生物的代謝產物在改善NAFLD癥狀過程中發揮著重要作用；而雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌可以通過調節機體血清中的脂質、轉氨酶、炎癥因子及抗氧化物質等代謝產物來降低NAFLD對機體的損傷[11-13,31]。因此,鼠李糖乳桿菌 hsryfm 1301發酵乳可能是通過調節腸道微生物來改善機體血清中脂質、轉氨酶等代謝產物,進而發揮其對NAFLD人肝細胞L-02的益生作用。

益生菌還能通過調節SIRT-1/PGC-1α/SREBP-1、Nrf-2/HO-1和PPAR-α等與血脂、抗氧化物質及膽汁酸代謝途徑相關基因的表達來減輕機體的NAFLD癥狀[8,32-33]。因此,后續將從腸道微生物-血清的代謝產物及其代謝通路等方面入手,進一步闡明鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301發酵乳干預的大鼠血清在NAFLD模型中對人肝細胞L-02的益生作用機制。