去糖基化對水溶澳洲堅果糖肽結構和抗氧化性的影響

向媛嫄,王文林,宋海云,黃雪松*

1(暨南大學 理工學院,廣東 廣州,510632) 2(廣西南亞熱帶農業科學研究所,廣西 崇左,532415)

澳洲堅果(MacadamiaternifoliaF.Muell),又稱夏威夷果、澳洲核桃等,是一種亞熱帶堅果,產于澳大利亞昆士蘭州和新南威爾士州等,屬山龍眼科[1]。脫脂或低脂澳洲堅果油粕粉作為澳洲堅果油生產的副產品,可作為食品和飲料中營養豐富的配料[2],其含有豐富的蛋白質、多糖和糖肽[3]。研究糖鏈對澳洲堅果多肽各種功能性質的影響對開發澳洲堅果油粕粉產品有一定的指導作用。

糖基化反應是一種生物體內很普遍的翻譯后修飾的過程,常常影響蛋白質的結構和生物活性[4]。DEN STEEN等[5]使用核磁共振評估了糖基化的糖肽片段,18 kDa的蛋白質被高度糖基化,核心O-糖鏈與肽相互作用,被約束為特定構象,使肽主鏈更加穩定;王岸娜等[6]發現除去獼猴桃糖蛋白O-糖鏈會破壞蛋白質二級結構中β-折疊,從而降低糖蛋白的抗氧化性;此外糖鏈還可以保護半胱氨酸免受氧自由基的攻擊[7]。就蛋白質的二級、三級、四級結構而言,糖鏈的釋放必將會導致肽鏈的重新折疊從而影響肽鏈的結構,在某些情況下這些結構影響其功能。例如葡糖淀粉酶用α-甘露糖酶處理后酶活性降低[8],說明葡糖淀粉酶的O-糖鏈在淀粉水解中起重要作用。因此研究多糖對蛋白結構和性質的影響對于改造和利用豐富的蛋白資源很有必要。本文用β-消除法釋放澳洲堅果糖肽中的O-糖鏈,通過圓二色譜儀觀察去糖基化前后澳洲堅果糖肽中肽鏈二級結構變化;差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)分析去糖基化對其熱穩定性的影響;掃描電子顯微鏡觀察微觀結構變化,測定去糖基化前后澳洲堅果糖肽體外抗氧化活性的變化。研究了糖基化對澳洲堅果糖肽的結構和性質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

澳洲堅果油粕,廣西省岑溪市壽香鄉有機農產品開發有限公司；DEAE-52 纖維素,美國GE 公司；Sephadex G-100 凝膠,上海源葉生物科技有限公司；DPPH、濃硫酸、鹽酸、NaCl,均為分析純,天津市津東天正精細化學試劑廠；無水乙醇、三氯乙酸、雙氧水、苯酚,均為分析純,廣州化學試劑廠；SDS-PAGE超低分子質量標準品,廣州碩譜生物科技公司。

1.1.2 儀器與設備

SCIENTZ-10 N冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-9600紫外-可見分光光度計,北京瑞利分析儀器公司；LC-20A高效液相色譜儀、TM3030Plus型掃描電子顯微鏡,日本島津公司；DSC-1差示掃描量熱儀,梅特勒-托利多公司；圓二色光譜儀,英國應用光物理公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 澳洲堅果糖肽的提取純化

分離：取冷榨脫脂澳洲堅果油粕粉250 g,加入2 L蒸餾水,60 ℃水浴加熱2 h。冷卻離心(3 500 r/min,20 min)保留上清液,減壓濃縮；向濃縮液中加入無水乙醇至乙醇體積分數為10%,離心(3 500 r/min,20 min)除去蛋白質等沉淀物,收集上清液繼續加無水乙醇至乙醇體積分數為60%,離心(3 500 r/min,20 min)收集沉淀物。重新溶解并減壓濃縮,冷凍干燥得澳洲堅果糖肽粗提物。

純化：取澳洲堅果糖肽粗提物250 mg,溶于10 mL蒸餾水。充分溶解后上樣到DEAE-52纖維層析柱中,分別用0、0.1、0.2 mol/L的NaCl溶液洗脫,收集洗脫液每管10 mL。測每管溶液在波長280 nm處的吸光度,苯酚-硫酸法測量每管溶液在波長490 nm處的吸光度。以管數序號為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制洗脫曲線。收集既有糖又有蛋白的樣品峰,濃縮后用8 kDa透析袋透析。取適量上述溶液上樣到Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析柱中,蒸餾水緩慢洗脫,收集洗脫液每管5 mL,同樣的方法在波長280和490 nm處測每管洗脫液吸光度,收集糖肽樣品峰,透析凍干,得率為3.5%。

1.2.2 糖肽的純度和分子質量鑒定

通過高效液相色譜凝膠過濾色譜法測定澳洲堅果糖肽(macadamia glycopeptiole,MGP)的純度[9],采用PolySep-GFC-P4000柱(7.8 mm×300 mm),以蒸餾水為流動相,進樣量10 μL,流速0.5 mL/min,檢測器為蒸發光散射器(evaporative light-scattering detector,ELSD)。

用超低分子質量標準品來測定糖肽的分子質量,該標品由3種多肽和2種低分子質量蛋白組成,分子質量分別為20 100、14 400、7 823、5 856、3 313 Da。采用Tricine-甘油SDS-PAGE測定分子質量，根據文獻[10]制備凝膠液和電泳液。

根據表1制備分離膠,聚合后制備夾層膠,最后制備濃縮膠。3種膠長度比為4∶1.5∶1。電壓：30 V 1 h,100 V至結束。電泳之后將膠在固定液中固定10～20 min,再進行染色,一般染色20～30 min即可脫色。

表1 電泳膠配制表Table 1 Preparation of electrophoresis gel

1.2.3 糖苷鍵組成

β-消除法[11]除去糖鏈：500 mg糖肽與5 mL 0.3 mol/L NaOH溶液和5 mL 1 mol/L硼氫化鈉溶液混合,35 ℃反應24 h,2 kDa透析袋透析24 h。濃縮凍干得到澳洲堅果糖肽的肽鏈(macadamia glycopeptide peptide,MGPP)。比較反應前后樣品在波長240 nm處的紫外吸收是否有變化,以此確定糖肽中是否存在O-糖肽鍵。

1.2.4 圓二色譜分析

將MGP和MGPP溶于水配成0.1 mg/mL的溶液,用10 mm 光徑樣品池掃描(波長260～190 nm),掃描速度100 nm/min,響應時間1 s。

1.2.5 DSC分析

使用DSC測定MGP和MGPP在水溶液中的變性溫度。稱取MGP和MGPP配成0.5 mg/mL水溶液,分別取50 μL于鋁盒中。氮氣流速設定20 mL/min,在25～200 ℃ 掃描,升溫速率為25 ℃/min ,得到曲線。

1.2.6 掃描電子顯微鏡分析

導電膠粘于樣品臺,取微量凍干樣品MGP和MGPP均勻地粘在導電膠上,吹去浮沫,噴金后在掃描電子顯微鏡下觀察樣品的微觀結構。

1.2.7 體外抗氧化能力測定

(1)DPPH自由基清除率的測定[12]

用95%(體積分數)乙醇溶液配制0.2 mmol/L DPPH溶液,取2 mL置于試管中,加入2 mL不同質量分數的MGP和MGPP樣品溶液,旋渦混勻,室溫下反應30 min,在517 nm波長處測其吸光度。DPPH自由基清除率根據公式(1)計算:

(1)

式中：A1,待測樣品的吸光度；A2,95%乙醇溶液代替DPPH溶液的吸光度；A0,95%乙醇溶液代替樣品的吸光度。

(2)·OH清除率的測定[13]

取樣品2 mL,加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4、2 mL 6 mmol/L的H2O2,旋渦混勻反應10 min后加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸混勻,室溫靜置30 min,510 nm波長處測吸光度。·OH清除率根據公式(2)計算:

(2)

式中：A1,待測樣品的吸光度；A2,雙蒸水代替H2O2測得的吸光度；A0,水代替樣品測得的吸光度。

(3)還原力的測定[13]

2 mL樣品中加入2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和2 mL 10 g/L的鐵氰化鉀溶液,混勻后于50 ℃水浴中反應20 min,室溫放置冷卻后加入2 mL 100 g/L的三氯乙酸溶液,混勻后取出2 mL,與2 mL蒸餾水以及0.4 mL 1 g/L的FeCl3溶液混勻,靜置10 min,在700 nm波長處測定其吸光度,還原力與吸光度成正比。

1.3 數據處理

3次重復試驗的結果以(平均值±標準差)表示,使用Excel 2019數據處理,實驗數據運用SPSS 26.0進行統計分析,Origin 2019 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 分離純化分析結果

由圖1-a可知，經DEAE-52洗脫后出現3個吸收峰,其中0.1 mol/L NaCl溶液的洗脫部分(峰2)既有蛋白又有糖的吸收,即該濃度洗脫部分應為糖肽,而且含量最多。收集該洗脫部分,透析凍干后經過Sephadex G-100凝膠柱洗脫,得到2個既有蛋白又有糖吸收的峰(圖1-b)；收集主峰(圖1-b中的4峰)透析凍干,得純澳洲堅果糖肽,命名為MGP。

a-DEAE-52纖維素洗脫圖；b-Sephadex G-100凝膠柱洗脫圖圖1 MGP分離純化圖Fig.1 MGP separation and purification diagram

2.2 純度和分子質量

MGP經HPLC的純度鑒定結果如圖2-a所示,HPLC圖譜呈現窄的單一對稱峰,可認為MGP是均一糖肽,保留時間為9.741 min。Tricine-甘油 SDS-PAGE電泳結果如圖2-b所示,因為糖肽中的糖鏈有許多為不對稱形結構,糖單元具有不均一性,這種非均一性源于寡糖鏈接位點的非均一性和連接于同一位點上寡糖的非均一性[14]。導致含糖蛋白質的電泳行為與一般蛋白質有所不同,多糖復合物解離程度較微弱,電荷密度低,糖肽的電泳帶呈帶狀分布[15]；MGP的電泳圖亦見到此現象。小分子肽在電泳過程中本身就會出現彌散現象,使電泳帶比一般的蛋白電泳帶寬,與本文中MGPP和標準蛋白電泳行為相符合。溴酚藍為指示劑,其遷移率為1.0,以蛋白和多肽的相對遷移率對分子質量對數做標準曲線為y=-2.185 5x+5.030 7(R2=0.995 9)。根據MGP和MGPP的相對遷移率求得MGP的分子質量約為12 kDa,MGPP的分子質量約為9 kDa。

a-MGP的高效液相色譜圖；b-Tricine-甘油SDS-PAGE電泳圖1-MGPP；2-MGP；3-標準分子質量圖2 純度和分子質量鑒定圖Fig.2 Identification diagram of purity and molecular mass

2.3 糖苷鍵類型

MGP經β-消除后,240 nm波長處吸光度明顯增加(圖3),當蛋白質中的絲氨酸或蘇氨酸與多糖結合形成O-糖肽鍵時,稀堿處理(即發生β-消除反應)會發生解離,絲氨酸或蘇氨酸殘基會形成α-氨基丙烯酸或α-氨基丁烯酸,在240 nm波長處有特征吸收[16]。據此可以推斷：MGP中糖和肽鏈是通過O-糖肽鍵連接的。

圖3 β-消除反應前后紫外掃描光譜圖Fig.3 UV scan spectrum before and after β-elimination reaction

2.4 圓二色譜分析結果

蛋白質的二級結構主要通過非共價力維持,當分子內環境發生變化時,蛋白分子將重新排列,達到最低能量以維持相對穩定[17]。根據凝膠電泳測得的分子質量對MGP(12 kDa)和MGPP(9 kDa)的圓二色譜圖數據進行分析,得到2種多肽二級結構相對含量如表2所示。MGP經β-消除后所獲得的MGPP,其二級結構α-螺旋含量降低9.3%；β-折疊含量降低21%；β-轉角、無規則卷曲含量分別增加1.6%、28.7%。這表明糖基化會使MGP肽鏈二級結構更加穩定有序,這是因為高水平的α-螺旋、β-折疊含量高有助于肽鏈形成更緊密的蛋白結構或分布,改善蛋白的穩定性[18]。

表2 β-消除前后二級結構各組分相對含量 單位:%

2.5 DSC分析結果

蛋白質只有在水中才能呈現出特定的三維立體結構來支撐蛋白質的各種功能性質[19],因此蛋白質的熱變性溫度即蛋白質在水溶液中的變性溫度。MGP溶液和MGPP溶液的DSC曲線如圖4所示,曲線的最大吸收峰值所對應的溫度和峰面積即它們的熱變性溫度(Td)和焓變值(ΔH)[19]。MGP的熱變性溫度Td=148 ℃,焓變值ΔH=0.207 kJ/g；MGPP的Td=136 ℃,ΔH=0.138 kJ/g。Td反映熱穩定性,ΔH反映變性所需要的熱量,ΔH越大表明有序結構越多,蛋白的聚集程度越大[20]。上述結果表明MGP的熱穩定性(Td)和有序聚集程度(ΔH)都大于MGPP,即糖基化有助于肽鏈形成有序結構,提高肽鏈熱穩定性。

2.6 掃描電子顯微鏡分析結果

圖5為澳洲堅果糖肽MGP和肽鏈MGPP在掃描電鏡下放大200和2 000倍的表面形貌圖。在200倍和2000倍掃描電鏡上觀察到MGP有很多疏松多孔的網絡結構,網絡結構周圍光滑平整(圖5-a,圖5-b),說明分子間有相互作用力,能形成緊密而穩定的結構。與MGP相比,MGPP中緊密有序的網絡結構消失(圖5-c、圖5-d),出現一些雜亂無序的結構。MGP在冷凍干燥后仍能保持有序結構可能是由于糖鏈能夠自身形成糖網絡[21],可以加固蛋白網絡結構,使其在冷凍環境下更加穩定。

a-MGP×200；b-MGP×2000；c-MGPP×200；d-MGPP×2 000圖5 MGP β-消除反應前后的掃描電鏡圖Fig.5 SEM images before and after MGP β-elimination reaction

2.7 抗氧化分析結果

如圖6所示,隨著MGP質量濃度的提高,其DPPH、·OH清除能力和還原能力逐步提高,并有明顯量效關系,并在質量分數2%時分別達到最大,為60.3%、98.7%、1.45。與MGP相比,MGPP的DPPH清除率顯著降低,最大清除率由60.3%降到20.3%(圖6-a),除去糖鏈后,糖肽空間結構被破壞,疏水基團相互結合,使更多的親水氨基酸暴露,而DPPH是一種油溶性的自由基[12],肽鏈極性增加使它們更難捕獲油溶性的DPPH,導致DPPH的清除能力下降；·OH最大清除率由98.7%降到37.6%(圖6-b),由圓二色譜結果可知,消除糖鏈后多肽的β-折疊減少而無規則卷曲增加,研究發現β-折疊中的階梯狀結構[6]能夠將大部分氫鍵包裹在結構內,弱化了·OH對本身結構的影響,使之有更強的·OH清除能力,與本實驗得到的結果相符合；最大還原能力由1.4降到0.5(圖6-c),還原能力反映抗氧化劑供電子能力的強弱,有研究表明酸性或堿性氨基酸殘基對還原能力的影響很大[22],主要是由于這些氨基酸的氨基和羧基參與了金屬離子反應,使肽鏈供電子能力變差,阻礙了抗氧化反應[23]。去糖基化導致肽鏈中的酸性或堿性氨基酸暴露出來,使MGPP的還原能力下降。除了通過影響肽鏈分子空間結構,抗氧化活性的降低還可能與糖肽中糖鏈本身即具有抗氧化及清除自由基的能力有關。綜上所述,MGP具有較好的抗氧化活性,其結構上的O-糖基化有助于提高和穩定澳洲堅果糖肽的抗氧化活性。

a-DPPH自由基清除率；b-·OH的清除率；c-總還原力圖6 MGP和MGPP的體外抗氧化作用Fig.6 Antioxidant effects of MGP and MGPP in vitro

3 結論

本文從澳洲堅果油粕中分離純化得到分子質量約為12 kDa的澳洲堅果糖肽MGP,MGP經β-消除后得到分子質量約為9 kDa的肽鏈MGPP。研究結果表明：糖肽MGP為O-型糖苷鍵,其肽鏈的二級結構中較MGPP有更多的α-螺旋、β-折疊等有序結構,有更高的熱穩定性、抗氧化能力和更有序的顯微結構。因此,澳洲堅果糖肽的糖基化有助于維持澳洲堅果糖肽的空間結構,使MGP的結構和性能更加穩定,這對更好地發揮其多肽的生物功能、更好地利用豐富的動植物蛋白資源有重要意義。