低嘌呤、高納豆激酶活性枯草芽孢桿菌SH21篩選及發酵條件優化

龐遠祥,謝遠紅,金君華,劉慧,張紅星

(北京農學院 食品科學與工程學院,食品質量與安全北京實驗室,農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,北京,102206)

納豆激酶(nattokianse，NK)是在納豆發酵過程中由納豆枯草桿菌(Bacillussubtilisnatto)產生的一種具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶[1]，因可用于治療血栓、高血壓、阿爾茨海默氏病和玻璃體視網膜等領域而被廣泛關注[2-9]。

食物中主要含有4種嘌呤，分別為腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤，而人體痛風是由于長期嘌呤代謝障礙、血尿酸升高引起組織損傷的一類疾病[10]。然而，多種NK凍干粉產品中均具有較高含量的嘌呤類物質，不利于痛風患者的食用。目前，對NK研究主要集中在具有高酶活性微生物的篩選[11]、新型酶的純化以及特性研究[12-13]。因此，篩選出一種具有高NK酶活性、低嘌呤含量的發酵菌株，并在此基礎上對其液體發酵條件進行優化，可為進一步開發高NK酶活性、低嘌呤產量的枯草芽孢桿菌發酵產品奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大醬,四川大涼山農戶。

1.2 培養基

酪蛋白平板培養基(g/L)：酪蛋白胨20,葡萄糖5,K2HPO4·3H2O 1,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.1,瓊脂15,pH 7.0,121 ℃滅菌15 min。

種子培養基、LB 培養基(g/L)：蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl 10(固體培養基加15 g/L 瓊脂),121 ℃滅菌15 min。

初始液體發酵培養基(g/L)：胰蛋白胨20,乳糖20,Na2HPO4·12H2O 5,NaH2PO4·2H2O 1,CaCl20.2,MgSO4·7H2O 0.5,pH 7.0,121 ℃滅菌15 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌的篩選

產NK菌株篩選：取1 g大醬,放入裝有9 mL 無菌生理鹽水的試管中振蕩5 min,沸水浴加熱10 min,10 000 r/min離心5 min,取上清液進行梯度稀釋,以劃線分離法將上清液涂布于酪蛋白平板上,放入恒溫培養箱中,37 ℃培養24 h觀察平板透明圈直徑大小并進行測量,選取透明圈直徑大者轉接LB斜面培養。

搖瓶篩選：取初篩所得菌株接種于LB 培養基中,37 ℃,180 r/min 恒溫培養12 h,接入液體種子培養基,37 ℃,180 r/min 恒溫培養12 h。按2%(體積分數)的接種量將種子液接種至液體發酵培養基中,37 ℃,180 r/min 恒溫培養24 h,測定發酵液NK酶活力及嘌呤含量。

1.3.2 NK酶活力及嘌呤含量測定方法

1.3.2.1 NK酶活力測定

采用酪蛋白消化法[14]測定發酵液中NK酶活力。

粗酶液制備：將發酵獲得的菌液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min,取上清液經過0.22 μm膜過濾即為粗酶液。

酶反應：取1 mL粗酶液,加入2 mL 0.5%酪蛋白,混合均勻,40 ℃ 孵育10 min；加入3 mL 10% 三氯乙酸終止反應,8 000 r/min離心5 min。設立對照組,對照組為加入酶液前加入3 mL 三氯乙酸。

顯色反應：取1 mL酶反應液,加入5 mL 0.55 mol/L NaCO3溶液和1 mL福林酚溶液,迅速混勻,40 ℃ 恒溫水浴中顯色20 min,測定吸光度(A680)。

酶活力定義：1 min內形成1 μg酪氨酸所需的NK劑量。

1.3.2.2 嘌呤含量測定

采用高效液相色譜法[15]對發酵液中的嘌呤含量進行檢測。

前處理：取2 mL發酵上清液于25 mL具塞管中,加入2 mL 3 mol/L硫酸溶液,加塞后立即置于沸水浴水解10 min,冰浴冷卻,調pH至2.0～8.0,定容至10 mL。再以0.22 μm針式過濾頭過濾,即得待測樣品,備用。

色譜條件：色譜柱：ZORBAX NH2(4.6 mm×250 mm,5.0 μm)；流動相：A相,10 mmol/L乙酸銨,B相,乙腈；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL；紫外檢測波長：254 nm。

1.3.3 菌種鑒定

通過16S rRNA序列對菌株進行鑒定。采用TIANamp細菌DNA試劑盒提取總DNA。使用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增。擴增程序如下：95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,退火溫度55 ℃,復性30 s,72 ℃延伸5 min,進行34個循環。PCR產物經生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結果經BLAST(NCBI)比對分析。

1.3.4 單因素試驗

(1)培養基碳源優化：以初始培養基為基礎,分別使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉和甘油為碳源,測定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(2)培養基氮源優化：在現有優化基礎上,分別使用胰蛋白胨、酪蛋白胨、大豆蛋白胨和蛋白胨,測定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(3)培養基接種量優化：以初始培養基為基礎,將種子液以不同接種量(體積分數1%、2%、3%、4%、5%)接入發酵培養基中,測定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(4)培養基初始pH優化：在現有優化基礎上,改變發酵培養基的初始pH(5、6、7、8、9),測定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(5)培養溫度優化：在現有優化基礎上,調整發酵溫度(31、33、35、37、39 ℃),測定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(6)培養時間優化：在現有優化基礎上,調整發酵時間(24、36、48、60、72 h),測定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

1.3.5 Plackett-Burman試驗設計

在單因素試驗的基礎上,利用Design-expert軟件進行n=12的 Plackett-Burman試驗設計,其各因素與水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman 試驗因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.3.6 最陡爬坡試驗

爬坡試驗依據 Plackett-Burman 試驗結果確定各顯著影響因素及正負效應,設定步長及變化方向,以快速逼近最佳區域。

1.3.7 Box-Behnken中心組合試驗

利用最陡爬坡試驗得出中心點,設計3因素3水平優化試驗,采用Box-Behnken中心組合試驗進行實驗條件優化。試驗設計的各因素與水平如表2所示。

表2 Box-Behnken design 試驗因素與水平Table 2 Levels and factors of Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

酪蛋白平板篩選得到3株產透明圈菌株,搖瓶發酵分別測定其NK酶活力和嘌呤含量,SH21酶活力最高,嘌呤含量最低(表3)。

表3 三種菌株發酵液中納豆激酶活性和嘌呤含量的比較Table 3 Comparison of nattokinase activity and purine of the three strains

對SH21進行PCR擴增,產生了一段1 378 bp的DNA片段。經BLAST比對,發現與枯草芽孢桿菌(Genbank：MK860024)和枯草芽孢桿菌(Genbank：KP717559)的16S rDNA基因序列具有100%的同源性,結合其形態和生理特性,SH21被鑒定為枯草芽孢桿菌(Genbank：MN756647)。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 最佳碳源的確定

不同碳源對NK酶活力及嘌呤含量的影響如圖1-a所示。當碳源為葡萄糖時酶活力最高,為165.77 U/mL,嘌呤含量為91.54 mg/L；而碳源為蔗糖時嘌呤含量僅為43.01 mg/L,酶活力為134.04 U/mL,綜合考慮選擇蔗糖作為發酵培養基的碳源。

a-碳源種類對發酵產納豆激酶和嘌呤的影響；b-氮源種類對發酵產納豆激酶和嘌呤的影響；c-pH對發酵產納豆激酶和嘌呤的影響；d-接種量對發酵產納豆激酶和嘌呤的影響；e-溫度對發酵產納豆激酶和嘌呤的影響；f-時間對發酵產納豆激酶和嘌呤的影響圖1 各因素對酶活力以及嘌呤含量的影響Fig.1 The influence of various factors on enzyme activity and purine content

2.2.2 最佳氮源的確定

對于氮源而言(圖1-b),酶活力最高為酪蛋白胨，其值達到160.07 U/mL。其主要原因在于前期篩菌時采用的氮源為酪蛋白胨,因此對菌株具有一定的馴化作用[16],故以酪蛋白胨為氮源時酶活力較為顯著。而嘌呤含量雖以胰蛋白胨為氮源時嘌呤含量最低,但其相差不是很大,在21.78～39.33 mg/L之間,綜合比較選取酪蛋白胨作為最佳氮源。

2.2.3 最佳pH的確定

pH對酶活力和嘌呤影響如圖1-c所示。隨著pH的升高,酶活力先上升后下降,而嘌呤先下降然后上升后下降。當pH為7時,酶活力最高,為119.19 U/mL,而嘌呤含量雖然以pH為9時其嘌呤含量最低,但其差異不顯著,同時考慮到NK在中性條件下酶活力較為穩定[17],且該 pH 條件下適宜枯草芽孢桿菌的生長,故pH取7。

2.2.4 最佳接種量的確定

接種量在1%～3% 時,酶活力逐漸增加,嘌呤含量下降。當接種量大于3%,酶活性降低,嘌呤含量增加(圖1-d)。接種量在1%～3% 時,隨著接種量的增加,菌體繁殖速度加快,酶活也相應增加,當接種量大于3% 后,由于營養物質匱乏導致其生命活力逐漸降低,酶活力也相應降低[16]。故接種量設為3%。

2.2.5 最佳發酵溫度的確定

溫度對酶活力和嘌呤影響如圖1-e所示。隨著溫度的提高,酶活力逐漸增加,在37 ℃時酶活力達到最大值(128.96 U/mL),此時嘌呤含量為45.77 mg/L,隨后酶活力開始下降,嘌呤含量開始增加。故發酵溫度設為37 ℃。

2.2.6 最佳發酵時間的確定

不同發酵時間對NK酶活力及嘌呤含量的影響如圖1-f所示。在24～48 h時,酶活力逐漸增加,嘌呤含量逐漸下降。之后,隨著時間增加,酶活力降低,嘌呤含量增加,推測發酵時間過長,菌體生長進入衰亡期,甚至產生自溶,使得大量DNA釋放,導致酶活力下降,進而產生更多的嘌呤類物質[18]。因此最佳發酵時間為48 h。

2.3 Plackett-Burman試驗結果與分析

試驗結果見表4。由表5方差分析結果可知,酶活力模型的P值 0.001<0.05,模型選擇正確。接種量、pH、發酵溫度的P值均小于0.05,對NK酶活力影響顯著,發酵時間對酶活力影響不顯著；嘌呤模型的P值為0.010 6<0.05,模型選擇正確,各變量P值均小于0.05,對嘌呤影響均顯著。綜合考慮選擇接種量、pH和發酵溫度進行下一步的優化。

表4 Plackett-Burman試驗結果Table 4 Results of Plackett-Burman experiments

表5 方差分析結果Table 5 The results of ANOVA

2.4 最陡爬坡試驗

以接種量、pH和發酵溫度為自變量,各因素試驗設計如表6所示。接種量2.5%,pH 6.5,發酵溫度38 ℃時,酶活力最高,嘌呤含量最低。因此,以第4組試驗水平作為 Box-Behnken中心點,進行優化試驗。

表6 最陡爬坡試驗設計及結果Table 6 Design and results of steepest ascent experiment

2.5 響應面試驗

2.5.1 試驗設計及結果分析

表7 Box-Behnken design 試驗結果Table 7 Results of Box-Behnken design experiments

方差分析結果如表8和表9所示。所選模型P值均小于0.01,差異極顯著,說明回歸方程模型具有高度顯著性；失擬項P值均大于0.05,差異不顯著,說明模型對試驗擬合程度良好；相關系數R2均在0.9以上,可以預測實驗結果。

表8 酶活力回歸模型的方差分析Table 8 Variance analysis (ANOVA) of enzyme activity regression model

表9 嘌呤回歸模型的方差分析Table 9 Variance analysis (ANOVA) of purine content regression model

2.5.2 模型預測與驗證實驗

利用Design-expert軟件,分析3種顯著因素(接種量、pH、溫度)的響應面和等高線。預測得到發酵培養基最佳參數為接種量3%,pH 6.0,溫度37.93 ℃,理論最高酶活力可達到202.53 U/mL,嘌呤含量最低為50.068 mg/L。考慮實際限制,將發酵溫度調整為38 ℃。為了驗證響應面分析的可靠性,利用上述最佳參數進行3次平行驗證,實際測定酶活力為204.52 U/mL,嘌呤含量為51.27 mg/L,接近模型預測。

3 結論

通過兩步法從大醬中篩選得到1株低嘌呤、高酶活力的枯草芽孢桿菌SH21,在單因素試驗的基礎上,利用 Plackett-Burman設計篩選得到pH、接種量和發酵溫度這3個顯著因素,利用 Box-Behnken 中心組合設計確定最優發酵條件,確定了優化后的發酵培養基為20 g/L蔗糖、20 g/L酪蛋白胨、5 g/L Na2HPO4·12H2O、1 g/L NaH2PO4·2H2O、0.2 g/L CaCl2、0.5 g/L MgSO4·7H2O；優化后的發酵條件為pH 6.0,接種量3%,發酵溫度38 ℃,發酵時間 48 h,在此條件下,NK酶活力提高了1.22倍,嘌呤含量降低了32%,本研究提高了產酶水平并降低了生產成本,為開發高NK酶活性、低嘌呤產量的枯草芽孢桿菌發酵產品奠定研究基礎。