高效陰離子交換色譜-脈沖安培法測定母乳及嬰兒配方粉中的唾液酸

茹元樸,陳君,張明輝,喬為倉,趙軍英,侯俊財,陳樹興*,陳歷俊*

1(河南科技大學 食品與生物工程學院,河南 洛陽,471023) 2(北京三元食品股份有限公司 國家母嬰乳品健康工程技術研究中心,北京市乳品工程技術研究中心,母乳研究技術創新中心,北京,100163) 3(東北農業大學 食品學院,黑龍江 哈爾濱 150030)

唾液酸(sialic acids,SA)，又稱神經氨酸，是一類含有9碳的酸性氨基糖[1]，主要在糖蛋白和糖脂的末端以短鏈殘基的形式存在[2]。唾液酸廣泛分布于自然界各種生物體中，在哺乳動物的腦、乳、血液和神經組織黏蛋白中含量較高[3]，積極參與體內蛋白水解保護、細胞識別、生殖、感染、免疫和認知發育等生物學作用[4]。

母乳中含量豐富的唾液酸，對嬰幼兒神經系統的發育以及抵抗腸道感染發揮重要作用[5]。當母乳不足時，嬰兒配方粉成為母乳主要的替代品。然而嬰兒配方粉中的唾液酸在含量、種類以及結構方面與母乳差異較大[6]，有研究表明，母乳喂養的嬰兒在認知發育方面的總體得分高于嬰兒配方奶粉喂養。為了更好地匹配母乳成分，嬰兒配方奶粉已經將唾液酸作為奶粉優化的參數之一[7]。

唾液酸的檢測方法主要有分光光度法[8]、高效液相色譜法[9-10]、氣相色譜法[11]、質譜分析法[12-13]和核磁共振法等[11]。分光光度法的優點是簡單快捷，但不能區分唾液酸的結構，且對樣品的純度要求較高；高效液相色譜法和氣相色譜法都需要衍生處理，實驗過程復雜；液相色譜-質譜聯用靈敏度高，不需要衍生，然而回收率較差；核磁共振法的樣品需求量大且靈敏度較差，更適合對唾液酸的定性[11]。

高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD)主要用于糖類物質的檢測。此方法不需要衍生、操作簡單、具有良好的選擇性、靈敏度較高且環境友好，適用于乳源唾液酸的檢測。TANG等[14]采用HPAEC-PAD法對牛乳及制品中的Neu5Ac和Neu5Gc同時進行檢測，但該方法不能適用于嬰兒配方粉中唾液酸的檢測，因為嬰兒配方粉中含有的雜質化合物會干擾唾液酸的離子峰圖。有報道采用離子色譜法測定母乳中游離唾液酸[15]，但還未應用于母乳中總唾液酸的檢測，目前,能同時應用于母乳和嬰兒配方粉中唾液酸的檢測方法國內外還未見報道。

本文采用酸水解法提取不同結合形態中的唾液酸，使用離子色譜前處理柱純化嬰兒配方粉水解液，建立了高效陰離子色譜-脈沖安培法測定母乳和嬰兒配方粉中Neu5Ac和Neu5Gc的方法，并應用該方法測定不同泌乳期母乳及不同階段市售嬰兒配方粉中唾液酸的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器

Dionex ICS-6000離子色譜、Dionex CarboPac PA20分析柱(3 mm×150 mm，填料：樹脂)、Dionex CarboPac PA20保護柱(3 mm×30 mm，填料：樹脂)，Thermo Scientific公司；Cleanert IC-A前處理小柱(1cc 50/pkg)、0.22 μm濾膜，Agela公司；Milli-Q.A10超純水凈化器，美國MILLIPORE公司；3K-15高速冷凍離心機，美國Sigma公司；Polystat K6恒溫水浴鍋，德國Huber公司；AL104電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 樣品與試劑

母乳(初乳、過渡乳、成熟乳),北京三元食品股份有限公司國家母嬰乳品健康工程技術研究中心提供；嬰兒配方奶粉(Ⅰ段、Ⅱ段、Ⅲ段),各大超市；N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac,色譜純,純度≥97%)、醋酸鈉,Sigma公司；N-羥乙酰神經氨酸(Neu5Gc,色譜純,純度≥98.2%),源葉生物；NaOH、甲酸、H2SO4、鹽酸、三氟乙酸、三氯乙酸,均為分析純,Fisher Scientific公司；試驗用水為超純水。

1.3 標準溶液的配制

稱取一定質量的標品,將Neu5Ac溶于超純水中,Neu5Gc分別溶于超純水和50 mmol/L NaCl溶液,并按表1中的質量濃度配制混合標準系列工作液。

表1 標準系列工作液中Neu5Ac和Neu5Gc的質量濃度Table 1 Mass concentrations of Neu5Ac and Neu5Gc in standard series working solutions

1.4 樣品前處理

母乳和嬰兒配方粉樣品的前處理過程如圖1所示。

圖1 樣品前處理流程圖Fig.1 Flow chart of sample pretreatment

1.4.1 母乳

吸取200 μL母乳于離心管中,加入200 μL質量分數20%的三氯乙酸溶液沉淀蛋白,混勻后冰浴10 min,在4 ℃、3 000 r/min條件下離心30 min。將上清液移入新的離心管,于沉淀中加入500 μL冷的5%的三氯乙酸溶液洗滌,充分混勻后繼續在4 ℃、3 000 r/min條件下離心30 min,吸取上清液到第1次的上清液中。合并上清液并加入1 mL 0.1 mol/L三氟乙酸溶液80 ℃水解30 min。將處理后的沉淀中加入1 mL 體積分數0.1%鹽酸,80 ℃水解 75 min,取出后冷卻至室溫。將2組水解液混合,用超純水定容至10 mL,混勻。吸取1 mL母乳定容液過0.22 μm有機濾膜,濾液按色譜條件分析。

1.4.2 嬰兒配方粉

精確稱量1 g奶粉于10 mL超純水中,加熱至50 ℃,使奶粉充分溶解。按1.4.1的方法對復溶嬰兒配方粉進行處理,并定容至10 mL進行純化。首先將Cleanert IC-A小柱用10 mL超純水活化,靜置10 min,然后加入1 mL奶粉定容液。用5 mL的超純水清洗,以去除樹脂中任何未帶電的殘余化合物。最后用5 mL的50 mmol/L NaCl溶液將結合在樹脂上的唾液酸洗脫下來。吸取1 mL洗脫液過0.22 μm有機濾膜,濾液按色譜條件分析。

1.5 色譜條件

采用CarboPac PA20(3 mm×150 mm)分析柱,Dionex CarboPac PA20(3 mm×30 mm)保護柱,ED6000脈沖安培檢測器,Au工作電極,Ag/AgCl參比電極,糖標準四電位波形。柱溫30 ℃,檢測器溫度30 ℃,流速0.5 mL/min,進樣量為10 μL,以A:超純水、B:1 mol/L醋酸鈉、C:200 mmol/L NaOH為淋洗液進行梯度洗脫,洗脫程序如表2所示。

表2 梯度洗脫程序表Table 2 Gradient elution procedure

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

CarboPac PA20色譜柱具有柱容量小、能分離常見的單糖和多糖等特點,更加適合分離保留性較強和復雜基質的化合物。在CarboPac PA20柱上等度洗脫和梯度洗脫對Neu5Ac和Neu5Gc的影響如圖2所示,采用50 mmol/L的醋酸鈉和100 mmol/L NaOH溶液對2種標品進行等度洗脫,發現此時Neu5Ac的響應值高且分離度達到4.51,但Neu5Gc的響應值和分離度過低(圖2-a)。而采用20～300 mmol/L的醋酸鈉和100 mmol/L NaOH溶液在5～15 min進行梯度洗脫時(圖2-b),發現Neu5Gc的響應值高,分離度達到3.43,但Neu5Ac的分離度卻又降低,且基線不穩定。結合這2種洗脫方法,不斷優化,最終的梯度洗脫程序如表2所示。離子流圖如圖2-c所示,此時的峰形尖銳、對稱性好、基線穩定、響應值和分離度都高,更有利于含量較低的Neu5Gc的檢測和定量。

a-等度洗脫；b-梯度洗脫1；c-梯度洗脫2；1-Neu5Ac;2-Neu5Gc圖2 不同洗脫程序的離子流圖Fig.2 Ion flow diagram of different elution procedures

2.2 樣品前處理優化

2.2.1 酸水解時間優化

唾液酸在母乳中主要與低聚糖結合,而在嬰兒配方粉中主要與蛋白質結合,再加上母乳和嬰兒配方粉含有大量乳糖、半乳糖、低聚糖等碳水化合物復雜基質,使得乳中唾液酸的檢測極具挑戰性[10]。為了能夠更好地檢測唾液酸的含量,一般通過化學水解法將唾液酸從結合態中釋放出來。

酸水解法是目前應用最廣泛的方法,通過溫和的酸加熱樣品至70～90 ℃實現水解。由于唾液酸在乳品中存在不同的結合形式,有研究通過離心分離低聚糖和蛋白,然后采用不同的水解條件對唾液酸進行處理,從而達到更好的水解效果[16]。LACOMBA等[17]對不同水解酸(稀鹽酸、三氟乙酸、稀硫酸、乙酸)進行了比較研究,結果顯示稀鹽酸和三氟乙酸的水解效果最好。本研究在此基礎上以母乳為對象,分別考察了鹽酸對沉淀部分(蛋白結合唾液酸)和三氟乙酸對上清液部分(低聚糖結合唾液酸)水解時間的影響。如圖3所示,鹽酸在75 min時對蛋白結合唾液酸的釋放效果最好,而低聚糖結合唾液酸在30 min時水解效果最佳。

a-低聚糖結合唾液酸；b-蛋白結合唾液酸;a對應左側縱坐標;b對應右側縱坐標圖3 唾液酸水解時間曲線Fig.3 Hydrolysis time curve of sialic acids

2.2.2 嬰兒配方粉純化條件優化

考察了不同濃度NaCl溶液(30、40、50、60、70、80 mmol/L)對唾液酸洗脫回收率的影響,由圖4可知,50 mmol/L NaCl溶液洗脫唾液酸的效果最好。然而由于奶粉樣品中增加了一定濃度的NaCl溶液,導致Neu5Gc的平均保留時間從13.916 min提前至13.666 min,HURUM等[9]的解決方案是繼續對洗脫液進行1∶2.5倍的稀釋,通過稀釋NaCl的濃度來消減其產生的影響。然而此方法會導致待測樣品中Neu5Gc的含量過低,從而影響樣品檢測。與此方法相比,本文通過將Neu5Gc溶于50 mmol/L NaCl溶液的方法來消除實驗誤差,能夠對純化后的奶粉樣品進行更加精準的檢測。

圖4 不同濃度NaCl溶液對唾液酸洗脫回收率的影響Fig.4 Effect of different concentrations of NaCl solution on the elution recovery rate of sialic acid

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性

在1.5條件下,對標準系列工作液進樣檢測,以質量濃度為橫坐標,以對應峰面積為縱坐標繪制標準曲線,計算標準曲線方程。如表3所示,Neu5Ac質量濃度在0.1～10 mg/L,與峰面積的線性關系良好,線性相關系數為0.999 9,此線性范圍適合檢測奶粉中Neu5Ac；由于母乳在不同泌乳期唾液酸的總量差別較大,因此需要用更大的線性范圍進行校正。Neu5Ac在線性范圍內均有良好的線性關系,相關系數均>0.999,各組分保留時間相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)均<0.97%。

表3 Neu5Ac和Neu5Gc的線性范圍和標準曲線Table 3 Linear range and standard curve of Neu5Ac and Neu5Gc

2.3.2 精密度

取30 mg/L的Neu5Ac和1 mg/L的Neu5Gc標品溶液按1.5條件連續進樣6次,離子峰面積RSD分別為1.26%和0.99%,表明此方法精密度良好。

2.3.3 檢出限和定量限

取一定濃度的Neu5Ac和Neu5Gc標品溶液,加水逐級稀釋,結果表明Neu5Ac的檢出限為3 μg/L,定量限為10 μg/L；Neu5Gc的檢出限為2 μg/L,定量限為6 μg/L,更適用于唾液酸的檢測。該方法與陳海嬌等[10]建立的液相色譜法相比,具有更低的檢出限，更適用于唾液酸的檢測,尤其是針對含量較低于Neu5Gc。

2.3.4 重復性

按1.4實驗條件對母乳和嬰兒配方粉進行前處理,并按1.5色譜條件對其唾液酸含量進行檢測,每組實驗6個平行。母乳樣品中Neu5Ac的RSD為4.51%,嬰兒配方粉樣品中Neu5Ac和Neu5Gc的RSD分別為1.1%和5.22%,說明該檢測方法的重復性良好。

2.3.5 穩定性

分別取1份母乳和嬰兒配方粉樣品,按1.4實驗條件處理后,分別在0、2、4、6、8、24、48、72、96 h上機檢測,平行測定3次,取其平均值。測得的樣品含量如圖5所示,樣品各組分含量隨時間增長逐漸減少,樣品8 h的RSD均<2.4%,檢測了4 d的日間穩定性,其RSD均<5.21%,結果表明樣品可以在較長時間保持穩定。

a-日內穩定性；b-日間穩定性；1-母乳Neu5Ac；2-嬰兒配方粉Neu5Ac；3-嬰兒配方粉Neu5Gc圖5 母乳與嬰兒配方粉樣品中唾液酸的日內和日間穩定性Fig.5 Intraday and inter-day stability of sialic acid in the samples of human milk and infant formula

2.3.6 加標回收率

取母乳和嬰兒配方粉樣品,分別按表4加入低、中、高濃度的標品,測定唾液酸含量,平行測定3次,取其平均值,計算回收率。各組分RSD均<2.65%,回收率在87.65%～102.33%,說明該方法具有良好的回收率。

表4 母乳和嬰兒配方粉樣品加標回收率Table 4 Spiked recoveries of milk and infant formula samples

2.3.7 樣品分析

分別取3個母親(A、B、C)的初乳、過渡乳和成熟乳,3個市售品牌(D、E為牛乳基嬰兒配方粉,F為羊乳基嬰兒配方粉)的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ段嬰兒配方粉,按照建立的方法進行唾液酸檢測,每個樣品平行測定3次,以繪制的標準校正曲線進行定量。

由表5可知,母乳各階段的唾液酸含量在483.534～1 595.897 mg/L,隨著泌乳期的增加,母乳中唾液酸含量逐漸減少(P<0.05),這與CLAUMARCHIRANT等[19]的報道一致,表明該方法具有較大的濃度檢測范圍。值得注意的是,由于本方法的檢出限低,能夠在部分母乳樣本中檢測到Neu5Gc,但人體本身不產生Neu5Gc,因這可能與人食用含有Neu5Gc的食物有關,如雞蛋、紅肉和乳制品等[20],LACOMBA[17]和QUIN等[21]的報道也支持該觀點。不同品牌和不同階段嬰兒配方粉中的唾液酸含量差異較大,這與配料以及各階段嬰兒配方粉的國家標準不同有關。其中,羊乳基嬰兒配方粉中Neu5Gc的含量高達54.85 mg/100 g,顯著高于牛乳基嬰兒配方粉中的含量(P<0.05)。現有的奶粉檢測方法大多只針對Neu5Ac，而本方法Neu5Gc的定量限為6 μg/L，能夠對其準確定量。文獻中報道的牛乳基嬰兒配方粉中Neu5Ac和Neu5Gc的含量分別在71～389 和3.8～5.5 mg/100g之間，本研究檢測結果也與文獻中報道的一致[8-9,16-21]，但未在其他文獻中找到有關羊乳基嬰兒配方粉唾液酸含量的報道。

3 結論

采用高效陰離子色譜-脈沖安培檢測法建立了能同時應用于母乳和嬰兒配方粉中唾液酸的檢測方法,通過離子色譜前處理柱純化唾液酸樣品,能夠有效減少樣品中的雜質,更適用于基質復雜的唾液酸樣品檢測。與傳統的液相色譜法相比,該方法不需要衍生,操作簡單,具有較好的重復性及穩定性。該方法的精密度高、檢出限低、檢測范圍廣,能夠廣泛應用于不同泌乳期的母乳及嬰兒配方粉中唾液酸的定量分析。