4種α-芋螺毒素來源多肽合成及功能鑒定

吳 赟，曹 錕，張廣獻(xiàn) （.廣東醫(yī)科大學(xué)廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 53808；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 50006）

芋螺毒素是海洋軟體動(dòng)物芋螺的毒管組織分泌的由10～50個(gè)氨基酸殘基組成的小肽[1]。芋螺毒素通過選擇性靶向不同類型的神經(jīng)遞質(zhì)受體或電壓門控離子通道，通常被用作神經(jīng)科學(xué)研究和藥物開發(fā)的分子工具[2?3]。根據(jù)芋螺毒素保守的信號(hào)肽序列，可以將數(shù)目繁多的芋螺毒素分成29 個(gè)超家族[4]。其中A?超家族芋螺毒素又可根據(jù)藥理學(xué)作用靶點(diǎn)進(jìn)一步分為α?、κA?、αA?家族。α?家族芋螺毒素具有典型的CC?C?C半胱氨酸框架，通常由12～19個(gè)氨基酸殘基組成，主要作用靶點(diǎn)為煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)[5]。煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)分為肌肉型和神經(jīng)型兩種，其中肌肉型nAChR 普遍存在于脊椎動(dòng)物骨骼肌細(xì)胞以及某些魚的放電器官細(xì)胞的質(zhì)膜上。受體與乙酰膽堿結(jié)合，引起Na+通道的開放，Na+流入靶細(xì)胞，使得質(zhì)膜去極化并引起細(xì)胞的收縮。α?芋螺毒素能與神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上nAChR的α亞基結(jié)合，從而競(jìng)爭(zhēng)性地抑制乙酰膽堿與受體結(jié)合，阻斷神經(jīng)?肌肉興奮信號(hào)的傳遞[6]。目前在具有抗皺功能的化妝品中廣泛應(yīng)用的蛇毒SYN?AKE 是1 種來源蛇毒的三肽[7]，它主要作用于肌肉型nAChR 的突觸后膜，從而抑制神經(jīng)肌肉收縮。本研究從α?芋螺毒素中篩選并合成了4 種多肽，探討這些多肽對(duì)肌肉收縮的抑制作用及其應(yīng)用前景，旨在為開發(fā)新型抗皮膚皺紋產(chǎn)品提供參考。

1 材料和方法

1.1 多肽合成

合成的多肽序列見表1。采用Fmoc 法[8]，通過全自動(dòng)多肽合成儀（海南建邦制藥科技有限公司，型號(hào)JB2014001）進(jìn)行多肽的合成。從儀器上裂解下來的多肽，用乙醚沉淀后，在1 500×g下離心10 min。收集沉淀，進(jìn)行冷凍干燥。取少量?jī)龈珊蟮拇蛛娜芙猓?jīng)10 000×g 離心2 min 去除雜質(zhì)后，上C18 反相柱進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)及純化。線性梯度洗脫，215 nm 和280 nm 處雙波長檢測(cè)。將HPLC 收集的目標(biāo)峰取1 μL，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)分析。確定多肽分子量正確后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，收集HPLC 純化后的目的峰，再次凍干。再經(jīng)HPLC 純化，經(jīng)檢測(cè)達(dá)到95%以上純度后，第3 次凍干成粉末，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 所合成的4個(gè)多肽序列

1.2 肌細(xì)胞收縮檢測(cè)

使用Cell Biolabs 公司的細(xì)胞收縮檢測(cè)試劑盒（Collagen?based Contraction Assay Kit,CBA?201）評(píng)估肌肉細(xì)胞的收縮性。將人骨骼肌細(xì)胞（HSMC，美國ATCC）在骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)基（skeletal muscle cell medium,SkMCM，ScienCell 公司，3501?b）中，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。將采集的細(xì)胞進(jìn)行重懸，使細(xì)胞終濃度為（2～5）×106個(gè)細(xì)胞/mL 培養(yǎng)基。將2倍體積的細(xì)胞懸液和8 倍體積的預(yù)冷的膠原凝膠溶液混合制成膠原晶格。在24 孔板的每個(gè)孔中加入0.5 mL的細(xì)胞?膠原混合液，在37 ℃孵育1 h。當(dāng)膠原聚合后，向凝膠晶格中添加1.0 mL 培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h，期間觀察膠原的收縮變化。在釋放收縮基質(zhì)之前，用濃度為100 μmol/L 的多肽溶液處理細(xì)胞1 h。24 h 后用直尺測(cè)量膠原凝膠大小的變化。使用細(xì)胞培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，蛇毒三肽SYN?AKE 作為陽性對(duì)照。收縮率（mm）=釋放前膠原凝膠的直徑?釋放24 h 后膠原凝膠的直徑。

1.3 骨骼肌收縮檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)所用SD大鼠購買自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SYXK（粵）2018?0182]。30 只大鼠（150～200 g）分為6 組，每組5 只。1 組為陰性對(duì)照組，用臺(tái)氏液代替多肽處理組織；1 組為陽性對(duì)照組（SYN?AKE）；剩余4 組分別檢測(cè)不同的樣品多肽。大鼠腹腔注射1 mL 10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉后，剃去大鼠后肢及軀干后背部的毛，剪開皮膚，小心剝離，暴露肌層。分離腓腸肌內(nèi)外側(cè)頭至踝關(guān)節(jié)，游離腓腸肌內(nèi)側(cè)頭肌腱，并用手術(shù)線結(jié)扎，剪斷。于腓腸肌根部肌腱處結(jié)線接張力換能器，坐骨神經(jīng)置于刺激電極上，接入BL?420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。以連續(xù)單刺激的方式給予坐骨神經(jīng)電刺激，刺激參數(shù)為：延時(shí)l00 ms，波寬0.5 ms，頻率0.5 Hz，強(qiáng)度5 V，掃描速度為4.00 s/div，待模型穩(wěn)定后，記錄腓腸肌收縮的張力大小作為多肽作用前的對(duì)照。用無菌脫脂棉給藥，待測(cè)藥品工作濃度為100 μmol/L。每隔5 min 給予坐骨神經(jīng)電刺激，記錄腓腸肌收縮曲線，至腓腸肌收縮作用至25 min。

1.4 細(xì)胞毒性檢測(cè)

使用96孔板培養(yǎng)和MTT染色法檢測(cè)多肽對(duì)人骨骼肌細(xì)胞的細(xì)胞毒性[9]。人骨骼肌細(xì)胞在骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。將細(xì)胞以約105個(gè)/mL 接種于96 孔板，每孔接種90 μL，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。按預(yù)設(shè)的濃度梯度分別加入10 μL 的多肽，使每孔中的多肽終濃度為1、2、5、10、20、50、100 μmol/L，每1 個(gè)梯度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。空白組加入100 μL 骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL 的MTT（5 g/L），然后置于37 ℃溫育4 h。小心除去上清后，每孔加入100 μL DMSO，振蕩約10 min 溶解沉淀，隨后用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD 值，波長490 nm。

1.5 皮膚刺激性/腐蝕性檢測(cè)

根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015 年版中毒理學(xué)試驗(yàn)方法中的皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)方法檢測(cè)多肽對(duì)家兔皮膚的刺激性/腐蝕性。新西蘭白色家兔4 只（質(zhì)量合格證號(hào)：44007600002312），身體質(zhì)量2.3～2.4 kg，購自廣州花都區(qū)花東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)[許可證號(hào)為SCXK（粵）2019?0023]。試驗(yàn)前24 h，將家兔背部脊柱兩側(cè)被毛剪掉，剪毛中不損傷皮膚表面，去毛范圍為3 cm×3 cm，涂抹面積為2.5 cm×2.5 cm。取0.5 mL 濃度為1 mmol/L 的多肽溶液涂抹在一側(cè)皮膚上，另一側(cè)涂0.5 mL 純化水作為對(duì)照，每天涂抹一次，連續(xù)涂抹14 d。涂抹1 h 后觀察結(jié)果，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015 年版的皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)表1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)分別與對(duì)照組比較，采用t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各圖中的所有誤差線表示至少3次重復(fù)計(jì)算的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果

2.1 多肽的合成與純化

所合成的4 個(gè)多肽（芋螺毒素SI[10]、Reg1d[11]和多肽片段SDPR、ELDGNG[12]）均選自A超家族芋螺毒素（序列見表1）。采用全自動(dòng)合成了上述多肽，并用RP?HPLC 對(duì)其進(jìn)行了純化，通過質(zhì)譜鑒定了多肽的分子量（圖1）。

圖1 經(jīng)HPLC純化后的4個(gè)多肽的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.2 多肽對(duì)肌細(xì)胞收縮的抑制作用

通過比較膠原凝膠在多肽處理前后的直徑變化，發(fā)現(xiàn)多肽Reg1d、SDPR 和ELDGNG 對(duì)人骨骼肌細(xì)胞的收縮有一定的抑制作用。而多肽SI 對(duì)骨骼肌細(xì)胞的收縮沒有明顯抑制作用（圖2）。以上結(jié)果均至少重復(fù)3次。

圖2 4個(gè)多肽對(duì)肌細(xì)胞收縮的抑制作用

2.3 多肽對(duì)骨骼肌收縮的抑制作用

使用芋螺毒素Reg1d 處理腓腸肌后，對(duì)肌肉收縮的抑制作用明顯，25 min 時(shí)的抑制作用與陽性對(duì)照SYN?AKE 的抑制作用相當(dāng)；芋螺毒素SI 對(duì)骨骼肌收縮只有微量的抑制作用；而多肽SDPR和ELDGNG則對(duì)腓腸肌的收縮沒有明顯作用（圖3）。

圖3 4個(gè)多肽對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠骨骼肌收縮的抑制作用

2.4 芋螺毒素Reg1d的細(xì)胞安全性檢測(cè)

根據(jù)以上肌細(xì)胞收縮和骨骼肌收縮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇了芋螺毒素Reg1d 進(jìn)行接下來的細(xì)胞安全性和皮膚安全性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在7 個(gè)檢測(cè)濃度下，Reg1d 對(duì)骨骼肌細(xì)胞的存活均沒有明顯毒性作用（圖4）。

圖4 芋螺毒素Reg1d對(duì)人骨骼肌細(xì)胞存活率的影響

2.5 芋螺毒素Reg1d的皮膚安全性檢測(cè)

根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015 年版中的皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)方法檢測(cè)芋螺毒素Reg1d 對(duì)家兔皮膚的刺激性/腐蝕性。在試驗(yàn)觀察期內(nèi)家兔均沒有出現(xiàn)紅斑和水腫；每天每只動(dòng)物平均積分為0，未見其他毒性反應(yīng)特征，表明1 mmol/L的Reg1d對(duì)皮膚多次給藥，無刺激性。結(jié)果見表2。

表2 芋螺毒素Reg1d對(duì)家兔多次皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

芋螺毒素對(duì)不同的離子通道、G 蛋白偶聯(lián)受體和神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體具有高度的特異性和親和力[13]。目前已經(jīng)有一些芋螺毒素正在處于臨床試驗(yàn)階段，其中的μ?芋螺毒素MVIIA，已被美國FDA 批準(zhǔn)用于治療難以控制的嚴(yán)重慢性疼痛[14]。α?芋螺毒素是nAChRs抑制劑，其在芋螺物種中的豐富表達(dá)，為尋找nAChRs的靶向藥物，提供了一個(gè)具有可變初級(jí)序列、結(jié)構(gòu)、藥理特性和作用方式的天然多肽庫[15]。某些α?芋螺毒素的高亞型選擇性是鑒定天然nAChR 亞型參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放調(diào)控的關(guān)鍵[16]。α?芋螺毒素的結(jié)構(gòu)/功能特性也促進(jìn)了具有更高效價(jià)和/或亞型選擇性的毒素多肽類似物的開發(fā)。在本研究中，主要考察4 個(gè)來源于α?芋螺毒素的多肽對(duì)于肌肉收縮的抑制作用，其中芋螺毒素Reg1d 對(duì)肌細(xì)胞和骨骼肌的收縮表現(xiàn)出了明顯的抑制作用，同時(shí)也具有的良好的安全性。

為減小芋螺毒素的分子量，使其更適合于藥物應(yīng)用，此前已經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道了一些方法，例如將芋螺毒素MII 或MrIA 的N 到C 端環(huán)化以及用二硒環(huán)化鍵取代二硫鍵[17?18]，用化學(xué)柔性間隔物替換芋螺毒素SIIIA序列中的部分氨基酸等[19]。然而，這些方法并不能完全去除芋螺毒素中的二硫鍵。芋螺毒素的分子量仍然較大。在本研究中，我們從α?芋螺毒素中選擇并設(shè)計(jì)了4 個(gè)多肽。其中包括2 個(gè)全長的芋螺毒素SI 和Reg1d，以及2 個(gè)來自于芋螺毒素的多肽片段SDPR和ELDGNG。我們期望通過相關(guān)的功能實(shí)驗(yàn)，了解多肽片段是否具有與完整毒素類似的活性。然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2 個(gè)多肽片段并未表現(xiàn)出優(yōu)于或接近完整毒素的活性，這可能與多肽片段的選擇有關(guān)。在芋螺毒素的氨基酸序列中，除了保持基本空間結(jié)構(gòu)的半胱氨酸外，剩余的氨基酸中有些與毒素的功能密切相關(guān)，有些與毒素的特異性相關(guān)，還有一些與毒素的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定相關(guān)。在接下來的研究中，我們將從更多的芋螺毒素中選擇更多的多肽片段來進(jìn)行功能檢測(cè)。

本研究選擇了來源于蛇毒的三肽化合物SYN?AKE 作為陽性對(duì)照。SYN?AKE 是一種基于合成蛋白質(zhì)片段的化學(xué)物質(zhì)，該片段源自廟蝰蛇蛇毒中的Waglerin?1 肽，可以減少肌肉細(xì)胞的收縮。因此，SYN?AKE 被廣泛地應(yīng)用到了抗皺類的化妝品中[20]。與SYN?AKE 相比，芋螺毒素Reg1d 表現(xiàn)出了相似的生物活性。雖然Reg1d 的分子量較大，但是它具有良好的生物安全性。在后續(xù)試驗(yàn)中，可以通過特定氨基酸的去除和替換，進(jìn)一步降低Reg1d的分子量，Reg1d依然有望開發(fā)成為一種新的原料，應(yīng)用于抗皺紋類化妝品中。