超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定血液中伊維菌素和丙硫苯咪唑的殘留量

方雅莉 （廣東醫(yī)科大學(xué)科研服務(wù)管理中心，廣東東莞 523808）

伊維菌素（IVM）和丙硫苯咪唑（BZs）是廣泛應(yīng)用于家畜的高效、廣譜、低毒抗生素類抗寄生蟲藥物[1?2]，也是目前國內(nèi)使用較為廣泛的抗寄生蟲藥[3]。市面上銷售的一種名為“百蟲靈”的廣譜殺蟲劑同時(shí)含有IVM 和BZs 成分，由于IVM 脂溶性較高，具有神經(jīng)毒性和發(fā)育毒素，在體內(nèi)殘留時(shí)間較長，因此按照世界衛(wèi)生組織5 級分類標(biāo)準(zhǔn)，它被列為高毒化合物。苯并咪唑類藥物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化的代謝物具有毒理作用，因此有必要針對IVM 和丙硫苯咪唑建立一種快速、高效的檢測方法。本文以超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中液相色譜法對血樣中的IVM和BZs進(jìn)行了檢測。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

IVM 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(98.5%），美國百靈威科技有限公司；BZs 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，美國AccuStandard 公司；甲醇色譜純(HPLC），德國默克公司；乙腈色譜純（HPLC），德國默克公司；乙酸銨色譜純（HPLC），美國西格瑪公司；甲酸色譜純(HPLC)，安普科技有限公司。空白血1份。

1.2 儀器和設(shè)備

Exion LC?MS/MS 超高效液相色譜?三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國ABSCIEX 公司；振蕩器德國艾卡（IKA）公司；電子天平日本島津公司；超純水器德國默克密理博公司；離心機(jī)美國西格瑪公司；水浴氮吹儀瑞典拜泰齊公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理 取解凍的血樣0.5 mL，邊振蕩邊緩慢加入2.5 mL 乙腈，8 000 r/min 振蕩5 min，10 000 r/min 離心5 min，將上清液分出，過0.22 μm 微孔濾膜，收集濾液，45 ℃氮吹近干，用初始流動(dòng)相定容至0.5 mL，供檢驗(yàn)。

1.3.2 溶液配制 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：精確稱取IVM、BZs 對照品適量，分別置于20 mL 的容量瓶中，用甲醇溶解并定容，超聲促溶，并充分搖勻，配制成1 g/L 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用移液槍各取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液于體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇水中，配制成100 mg/L 的混合工作液，用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇水梯度稀釋至0.01、0.05、0.10、0.30、0.50 mg/L 的混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件 UPLC 色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，ID 1.7 μm）；流動(dòng)相A：0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨的超純水；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL；梯度洗脫條件見表1。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，多掃描方式：多反應(yīng)檢測（MRM）。質(zhì)譜離子源參數(shù)為CUR：30；CAD：Medium；IS：5 500；TEM：550；GSI：50；GS2：50。2 種化合物質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表1 梯度洗脫條件

表2 兩種化合物質(zhì)譜參數(shù)

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

IVM準(zhǔn)確分子量為874.5，BZs準(zhǔn)確分子量265.3，分別配制500 μg/L，以注射的方式在正離子模式下進(jìn)行一級質(zhì)譜母離子全掃描，分子離子m/z 分別為892.5、266.1，IVM 為[+NH4+]的分子離子峰，丙硫苯咪唑?yàn)閇+H+]的分子離子峰，自動(dòng)優(yōu)化確定最高及次高響應(yīng)的二級離子m/z以及相應(yīng)的DP、CE、CXP等參數(shù)，具體見表2。

2.2 色譜條件優(yōu)化

本文分別研究了含有0.1%甲酸、5 mmol/L 醋酸銨和0.1%甲酸、5 mmol/L 醋酸銨的超純水作水相；乙腈、甲醇作為有機(jī)相，以靈敏度和峰形作為評判條件，最終發(fā)現(xiàn)含有5 mmol/L醋酸銨和0.1%甲酸的超純水作水相，乙腈作為有機(jī)相，選擇梯度洗脫，以相對高的流速低比例的有機(jī)相作為起始流動(dòng)相，提高分析效率和靈敏度。

2.3 樣品的提取

本文采用較為簡單的乙腈蛋白沉淀法，過程提取回收率約為92%，步驟簡單，大大提高了樣品前處理的效率。

2.4 方法的檢測限和線性范圍

在本文方法所確定的試驗(yàn)條件下，進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集與分析，以濃度分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)y，分別繪制質(zhì)量濃度為10～500 μg/L 的IVM 和BZs 標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。見圖1～2。按照1.3.1 樣品前處理的方法，分別測定IVM、BZs 0.5、1.0、5、10 μg/L的加標(biāo)空白血樣定量離子信噪比，根據(jù)信噪比（RS/N）>10 的定量下限要求，可知BZs 的檢出限為5 μg/L，定量檢出限為5 μg/L；IVM 的檢出限為0.5 μg/L，定量檢出限為1 μg/L。見圖3～4。

圖1 IVM標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸

圖2 BZs標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸

圖3 IVM定量下限的信噪比圖譜

2.5 加標(biāo)樣品回收率

兩種藥物在10～5 000 μg/L 添加水平下，平均回收率為91.5%～93.2%，RSD 為2.1%～3.6%，提示本方法可以同時(shí)檢測生物檢材中的2種藥物。見表3。

表3 IVM和BZs的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

圖4 BZs定量下限的信噪比圖譜

3 討論

IVM 和BZs在日常生產(chǎn)生活中應(yīng)用廣泛，目前有分別使用液相色譜法檢測BZs[4?5]和使用液相色譜質(zhì)譜法、液相色譜法檢測IVM[6?11]的文獻(xiàn)報(bào)道，未檢索到使用超高效液相色譜質(zhì)譜法對IVM 和BZs 進(jìn)行檢測的文獻(xiàn)報(bào)道。本文以超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中液相色譜法對血樣中的IVM 和BZs 進(jìn)行檢測，僅需0.1～0.5 g樣品，經(jīng)90%的乙腈高速勻漿離心去蛋白，過微孔濾膜供檢，操作簡單，5 min 前能出峰，方法檢出限低，分析快速。在樣品前處理的方式上，目前常用的有QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）、固相萃取（Solid phase extraction，SPE）、液?液萃取（Liquid?liquid extraction，LLE）和分子印跡（Molecular imprinting technique，MIT）等技術(shù)，它們各有優(yōu)點(diǎn)，但普遍存在前處理復(fù)雜、耗時(shí)長等缺點(diǎn)。本文采用乙腈直接沉淀蛋白過微孔濾膜的形式進(jìn)行前處理，較為簡單且耗時(shí)短。總之，本文建立的UPLC?MS/MS 檢測方法回收率、準(zhǔn)確率高，具有高速、高分離度與高選擇性、高靈敏度的特點(diǎn)，能完全滿足生物體內(nèi)、外IVM和BZs的殘留檢測和驗(yàn)證需要。