羅漢果內生菌中乙醇降解菌株的篩選及其發酵條件優化

付 強，王 琪，周巧麗，金 岳，胡夢琪，趙豐麗，2

（1.廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541006；2.珍稀瀕危動植物生態與環境保護教育部重點實驗室，廣西 桂林 541006）

羅漢果是中國廣西特色經濟作物，為葫蘆科多年生宿根性藤本植物羅漢果的果實，含有三萜、黃酮、木脂素、呋喃、糖類、脂肪酸、甾體等，具有降糖、降脂、免疫調節、抗氧化等功效[1-3]。目前，我國對中藥降解乙醇作用的利用研究日益增多，如利用葛花、葛根和枳椇子為原料，得到降解乙醇效果較好的產品，可有效的降低酒精對人體帶來的傷害[4-9]。目前我國市場上的解酒產品，多以對中草藥的開發為主[10-14]，利用羅漢果內生菌進行降解乙醇的研究較少。

植物內生菌是植物微生態系統的重要組成部分[15-16]，在長期協同進化過程中，與植物形成和諧共生，互惠互利的關系[17-18]。從羅漢果內生菌中，張昌志等[19]篩選出了高效產環糊精葡萄糖基轉移酶的菌株；范彩琴等[20]篩選出多株具有良好抗氧化活性的菌株；龍楚媚[21]分離得到了一株具有高效降糖活性的菌株，表明羅漢果內生菌所產代謝產物具有多重功效。在內生菌降解乙醇能力研究方面，高慧[22]從韓國泡菜制品中篩選出一株具有良好降解乙醇能力的厭氧菌；孫志一等[23]從12種中草藥中分離純化得到5株降解乙醇能力較強的芽孢桿菌，展現出內生菌降解乙醇的潛力。

因此，本研究通過傳統培養分離法從羅漢果中分離內生菌，采用測定乙醇耐受性和重鉻酸鉀-硫酸法從中篩選具有降解乙醇能力的菌株，通過形態觀察及分子生物學技術對其進行鑒定，并以乙醇降解率為評價指標，通過單因素試驗及正交試驗對其發酵條件進行優化。以期為具有降解乙醇功能的產品提供一個新的途徑，為工業生產產品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

羅漢果：植株采自廣西桂林市龍勝縣。

1.1.2 主要試劑

重鉻酸鉀（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；葡萄糖、濃硫酸、無水乙醇（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養基[20]：土豆200 g，切塊，煮沸30 min，過濾，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L。

發酵培養基[20]：PDA培養基去除瓊脂。

初篩培養基[21]：硫酸鎂0.3 g、磷酸二氫鉀1.0 g、氯化鈉0.1 g、硫酸銨5 g、氯化鐵0.01 g、瓊脂22 g，蒸餾水定容至1 L，pH=7.0。滅菌完成后，待培養基冷卻至50 ℃，加入8%無水乙醇。

沙氏葡萄糖液體（Sabouraud dextrose broth，SDB）培養基[20]：葡萄糖40 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，麥芽糖5 g，蒸餾水定容至1 L。

沙氏培養基（Sabouraud dextrose medium with yeast extract，SDY）[20]：葡萄糖40 g，胰蛋白胨10 g，酵母浸膏2 g，氯化鈉0.5g，磷酸二氫鉀0.5g，七水硫酸鎂0.5g，蒸餾水定容至1L。

胨酵母浸膏葡萄糖（peptone yeast extract glucose，PYG）培養基[20]：胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 L。

以上培養基的滅菌條件均為121℃高壓蒸汽滅菌30min。

1.2 儀器與設備

BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HZ200LB型恒溫搖床、HP400S型生化培養箱：武漢瑞華儀器設備有限責任公司；Infinite M200Pro酶標儀：帝肯（上海）貿易有限公司；KQ-500VDE型雙頻數控聲波清洗器：昆山市超聲器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羅漢果內生菌分離純化

按參考文獻[24]中的方法對羅漢果組織進行消毒，將處理后的材料剪碎接種到PDA培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中培養，待菌落長成后，進行分離純化，得到羅漢果內生菌株。

1.3.2 乙醇降解菌的初篩

在無菌條件下，用劃線法將菌株接種于初篩培養基平板上，置于28 ℃恒溫培養箱中培養，定期觀察菌落生長情況。挑選生長情況良好（即耐受乙醇）的菌株即為初篩菌株。

1.3.3 乙醇降解菌的復篩

將初篩菌株接種于發酵培養基，裝液量100 mL/250 mL，30 ℃、130 r/min條件下發酵培養5 d，獲得菌株的發酵液用于復篩。

快速降解乙醇能力的測定：將待測菌株的發酵液500μL加入含8%乙醇的5mL發酵培養基中，混勻后37℃水浴反應1h。

緩速降解乙醇能力的測定：將待測菌株的發酵液500μL分別加入到體積分數分別為10%和20%乙醇的5 mL發酵培養基中，混勻后37 ℃水浴反應24 h。

兩組試驗的對照均為水代替發酵液，利用重鉻酸鉀-硫酸法[25]測定乙醇的殘留量，計算乙醇降解率，其計算公式如下：

式中：A空白組為空白組的吸光度值，A實驗組為實驗組的吸光度值。

1.3.4 乙醇降解菌的鑒定

形態學鑒定：采用點植法將菌株接種于PDA培養基上，觀察菌株的菌落大小、顏色及表面形態。并在光學顯微鏡下觀察菌體形態，對菌株進行初步鑒定。

分子生物學鑒定：菌株送武漢華大基因科技有限公司完成18S rDNA測序，并將該菌株的18S rDNA序列提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中采用局部序列比對基本檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源搜索，選取同源性較高的模式菌株的18S rDNA基因序列，應用MEGA軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.5 乙醇降解菌培養基篩選

種子液的制備：將復篩菌株接種于發酵培養基，裝液量250 mL/500 mL，30 ℃、130 r/min條件下發酵培養3 d。

按3%（V/V）的接種量將種子液分別接種于PDA、SDB、SDY、PYG四種液體培養基中，30 ℃、130 r/min條件下培養5 d，測定發酵液對乙醇的降解率。選取乙醇降解率最佳的培養基進行培養基優化試驗。

1.3.6 菌株降解乙醇發酵條件優化單因素試驗

將復篩菌株的種子液按3%的接種量接種于最優培養基中，裝液量250 mL/500 mL，初始pH值7.0，30 ℃、130 r/min條件下發酵5 d，測定發酵液對乙醇的降解率。在此基礎上，依次分別考察接種量（3%、4%、5%、6%、7%）、裝液量（100 mL/500mL、150mL/500mL、200 mL/500 mL、250mL/500 mL、300 mL/500 mL）、發酵溫度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、發酵時間（2 d、3 d、4 d、5 d、6 d）、初始pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）對乙醇降解率的影響，從而確定最佳發酵條件。

1.3.7 菌株降解乙醇發酵條件優化正交試驗

在單因素研究的基礎上，選擇對試驗結果影響大的因素接種量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、裝液量（D），以乙醇降解率作為評價指標進行4因素3水平的正交試驗，正交試驗因素與水平見表1。

表1 菌株G-1降解乙醇發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation conditions optimization of ethanol degradation of strain G-1

2 結果與分析

2.1 羅漢內生菌分離結果

通過傳統培養分離法從羅漢果根、莖和果實等組織中共分離純化得到68株內生菌。

2.2 乙醇降解菌株的初篩結果

通過初篩從羅漢果內生菌中篩選得到17株對乙醇具有耐受性的菌株，根據菌株的生長情況從中選取14株菌株進行復篩。

2.3 乙醇降解菌株的復篩結果

由圖1可知，復篩的14株菌株，都具有一定的降解乙醇的能力，綜合比較菌株G-1對乙醇降解效果最好，對體積分數8%乙醇作用1 h時，乙醇降解率為9.1%；對體積分數10%乙醇作用24 h時，乙醇降解率為16.7%，對體積分數20%乙醇作用24 h時，乙醇降解率為13.2%。因此，選擇菌株G-1進行進一步的研究。

圖1 基于重鉻酸鉀-硫酸法乙醇降解菌株的篩選結果Fig.1 Screening results of ethanol-degrading strains by potassium dichromate-sulfuric acid method

2.4 菌株G-1的鑒定

2.4.1 形態學鑒定

菌株G-1的菌落及細胞形態見圖2。由圖2可知，在PDA培養基上，菌株G-1菌落表面突起，菌落高3～5 mm，呈絮狀，菌絲呈白色，較為質密；背面為粉白色，略帶有紫色。分生孢子著生于菌絲上，在頂端聚成卵形。

圖2 菌株G-1的菌落（a）及細胞（b）形態Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphology of strain G-1

2.4.2 分子生物學鑒定

由武漢華大基因科技有限公司測得菌株G-1的18SrDNA基因序列堿基長度為534 bp，經過同源性序列檢索，結果顯示菌株G-1與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的18S rDNA序列同源性＞99%。在搜索比對結果中選擇與菌株G-1同源性較高的菌株，建立菌株G-1的系統發育樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株G-1與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）聚于一支，相似度最高，親緣關系最近。結合菌株G-1的形態觀察結果和分子生物學鑒定結果，最終確定菌株G-1為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

圖3 基于18S rDNA基因序列菌株G-1的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain G-1 based on 18S rDNA gene sequences

2.5 菌株G-1降解乙醇培養基的篩選結果

由圖4可知，采用PDA培養基對菌株G-1進行發酵得到的發酵液乙醇降解率最高，為21.3%，因此，選擇PDA作為最優培養基。

圖4 不同培養基對菌株G-1乙醇降解率的影響Fig.4 Effect of different media on ethanol degradation rate of strain G-1

2.6 菌株G-1降解乙醇發酵條件優化

2.6.1 接種量對菌株G-1乙醇降解率的影響

由圖5可知，隨著接種量的增大，乙醇降解率呈先升高后降低的趨勢。當接種量為6%時，菌株G-1的乙醇降解率最高，達24.8%。這是因為接種量對菌株的生長和活性物質積累起著重要作用，當接種量＜6%之前，菌株生長和活性物質積累時間過長，效率低下；當接種量＞6%之后，會引起溶氧不足，影響活性物質的產量和產生過多代謝廢物[26]。故確定最佳接種量為6%。

圖5 不同接種量對菌株G-1乙醇降解率的影響Fig.5 Effect of different inoculum on ethanol degradation rate of strain G-1

2.6.2 裝液量對菌株G-1乙醇降解率的影響

由圖6可知，隨著裝液量的增大，菌株G-1的乙醇降解率呈先升高后下降的趨勢。當裝液量為250 mL/500 mL時，菌株乙醇降解率最高，達25.78%。裝液量通過影響營養物質的含量和菌株需氧量來對菌株的活性進行影響，當裝液量＜250 mL/500 mL之前，可能其菌株積累活性物質所需的營養不足，導致乙醇降解率低；當裝液量＞250 mL/500 mL之后，可能其需氧量不足，菌株生長緩慢，活性物質積累不足[27]。故確定最佳裝液量為250 mL/500 mL。

圖6 不同裝液量對菌株G-1乙醇降解率的影響Fig.6 Effect of different loaded liquid on ethanol degradation rate of strain G-1

2.6.3 發酵溫度對菌株G-1乙醇降解率的影響

由圖7可知，隨著發酵溫度的升高，菌株G-1的乙醇降解率呈先升高后下降的趨勢。當發酵溫度為32 ℃時，乙醇降解率最高，可達26.8%。溫度對微生物的影響體現在影響細胞膜的流動性與細胞內生物大分子的活性，進而影響細胞的生長代謝。當發酵溫度＜32 ℃之前，可能達不到菌株生長的最佳溫度，菌株生長效率低；當發酵溫度＞32 ℃之后，可能過高的溫度對菌株的活性產生了影響，致使其活性物質積累較慢[28]。故確定最佳發酵溫度為32 ℃。

圖7 不同發酵溫度對菌株G-1乙醇降解率的影響Fig.7 Effect of different fermentation temperature on ethanol degradation rate of strain G-1

2.6.4 發酵時間對菌株G-1乙醇降解率的影響

由圖8可知，隨著發酵時間的延長，菌株G-1的乙醇降解率呈先升高后降低的趨勢。當發酵時間為4 d時，菌株G-1的乙醇降解率最高，達24.08%。分析原因可能是隨著發酵時間的延長，微生物的種群密度和代謝產物也會增加，但隨著營養物質的減少，微生物的種群密度和代謝產物會慢慢減低[28]。故確定最佳發酵時間為4 d。

圖8 不同發酵時間對菌株G-1乙醇降解率的影響Fig.8 Effect of different fermentation time on ethanol degradation rate of strain G-1

2.6.5 初始pH值對菌株G-1乙醇降解率的影響

由圖9可知，隨著初始pH值的增大，菌株G-1的乙醇降解率呈先升高后降低的趨勢。當初始pH值為6.0時，菌株G-1的乙醇降解率最高，達24.34%。分析原因可能是pH值對微生物生命活動的影響較大，當pH值＜6.0之前，環境對菌株細胞膜通透性產生了較大影響，不利于菌株發酵；當pH值＞6.0之后，環境對菌株影響漸漸變大，菌株發酵等受到了影響，使活性物質積累速率降低[28]。故確定最佳初始pH值為6.0。

圖9 不同初始pH值對菌株G-1乙醇降解率的影響Fig.9 Effect of different initial pH value on ethanol degradation rate of strain G-1

2.6.6 菌株G-1降解乙醇發酵條件優化正交試驗結果

采用PDA培養基，在單因素試驗的基礎上，確定初始pH值為6.0，選擇接種量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、裝液量（D）為影響因素，以乙醇降解率為評價指標，采用L9（34）正交設計研究不同因素對乙醇降解率的影響，正交試驗結果與分析見表2。

表2 菌株G-1降解乙醇發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Design and results of orthogonal tests for fermentation conditions optimization of ethanol degradation of strain G-1

由表2可知，根據極差分析，各因素影響菌株G-1乙醇降解能力的強弱順序為A＞C＞B＞D，說明接種量對試驗結果的影響最大，其次是發酵時間。各因素最優水平為A3B3C1D1，即接種量7%、發酵溫度32 ℃、發酵時間3 d、裝液量200 mL/500 mL。

2.6.7 驗證試驗結果采取優化后的培養條件對菌株G-1進行發酵，重復試驗3次，測得乙醇降解率為29.77%，是優化前的2.2倍。

3 結論

采用傳統培養分離方法從羅漢果中分離得到68株內生菌，通過測定乙醇耐受性和重鉻酸鉀-硫酸法篩選得到了一株具有降解乙醇能力的菌株G-1，經形態學和分子生物學鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。通過單因素試驗和正交試驗得出菌株G-1降解乙醇的最優發酵條件為發酵培養基PDA培養基，初始pH值6.0，接種量7%，裝液量200 mL/500 mL，發酵溫度32 ℃，130 r/min條件下振蕩培養3 d。在此優化條件下，菌株G-1的乙醇降解率為29.77%，是優化前的2.2倍。