響應面法優化副干酪乳桿菌發酵沙棘酸奶工藝

胡盼盼

（1.呂梁學院 生命科學系，山西 呂梁 033000；2.山西農業大學 動物醫學學院，山西 晉中 030801）

沙棘（Hippophae rhamnoidesLinn）屬于胡頹子科沙棘屬喬木或灌木[1]，擁有耐旱、抗風沙的特點[2]，在我國沙棘資源占世界沙棘資源的90%以上[3]，因此我國有“沙棘王國”之稱[4]。沙棘果實含有大量的超氧化物和維生素[5-6]，富含有人體所需的各種氨基酸[7]，以及沙棘黃酮[8]、亞油素、脂肪酸等活性物質，因此具有抗氧化[9]、抗菌、抗病毒以及抗糖尿病等生物活性[10]。酸奶是在純牛奶的基礎上經過高溫滅菌，加入發酵劑、白砂糖等輔料發酵后制成的味道酸甜和口感細膩的乳制品[11]，乳酸菌在發酵中會產生多種代謝物質，能調控腸道的菌群和滲透壓[12]，有利于腸道的通暢，可緩解便秘，營養價值優于鮮奶和奶粉。近些年購買酸奶的人群數量不斷增多，市場龐大，廣受人們的喜歡。

目前沙棘的食用主要為鮮食、榨汁飲用等[13]，很少將沙棘用于酸奶的研制，因此優化沙棘酸奶的加工工藝，可以使其營養價值和功效得到最大程度的利用。實驗室前期從新疆馬奶酒中自行篩選分離鑒定得到副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei）M5L，該菌株具有良好的發酵性能[14]及生物活性，并且已經驗證其菌體[15]、胞外多糖[16]、發酵液等具有免疫和抗腫瘤等功能。

本研究旨在在傳統原味酸奶的制作基礎上加入沙棘汁，以感官評分為響應值，通過單因素試驗及響應面法優化副干酪乳桿菌M5L發酵制備沙棘酸奶的工藝，這不僅可以提高酸奶的營養價值，并且能豐富酸奶的口味，為開發功能性沙棘酸奶及相關乳飲料提供理論依據和工藝參數，對我國沙棘的深加工具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei）M5L：分離自新疆馬奶酒中，由哈爾濱工業大學化學與化工學院保藏；新鮮沙棘：于每年九月份采摘自呂梁汾陽市城子沙棘種植基地；新鮮全脂牛奶：離石區趙家莊奶牛場；白砂糖（食品級）：市售。

1.2 儀器與設備

NLG380型電磁爐：舟山南菱電子科技公司；BSA224S型電子稱：廣東省精密儀器公司；BCD-98A128型冷藏柜：上海新飛歐品公司；ZHWY-200D型酸奶發酵箱：廣州省恩時科技公司；BILONJJ-2型榨汁機：山東曲阜市魯強機械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘酸奶制備工藝流程與操作要點

操作要點：選取新鮮沙棘為原料，摘下沙棘果洗凈并除去雜質，然后進行壓榨，之后用過濾布除去沙棘渣，得到澄清的沙棘汁并用保鮮膜密封備用。將沙棘汁、純牛奶、白砂糖按比例調配，加熱攪拌至沸騰并持續20 min，在超凈工作臺上降溫。然后按比例添加發酵劑，攪勻密封，放置到42 ℃培養箱中培養8 h，發酵完成后及時取出，降至常溫之后在4 ℃冷藏柜中放置12 h后進行感官評定和酸度值測定。

1.3.2 副干酪乳桿菌發酵制備沙棘酸奶的工藝優化

單因素試驗：在白砂糖添加量為8%、發酵劑用量為1%的工藝條件下，以酸度和感官評分為評價指標，考察沙棘汁添加量（6%、9%、12%、15%、18%）對沙棘酸奶品質的影響。在此基礎上，依次考察白砂糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%）和發酵劑添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）對沙棘酸奶品質的影響。

響應面試驗：根據Box-Behnken試驗設計，基于單因素試驗結果，選取沙棘汁添加量（A）、白砂糖添加量（B）及發酵劑添加量（C）為考察因素，以感官評分（Y）為響應值，應用Design-Expert 10.0進行優化試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 沙棘酸奶發酵工藝優化響應面試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for sea-buckthorn yogurt fermentation process optimization

1.3.3 分析測定方法

感官評定：根據中國乳制品工業行業規定RHB103《酸牛乳感官質量評鑒細則》[17]，選取顏色、口味、風味、組織形態作為產品評分的標準。挑選10名專業人員分別對成品酸奶進行打分（總分為100分），計算出10名人員得分的平均值即為該發酵酸奶的感官評分，其評分標準見表2。

表2 酸奶的感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of yoghurt

微生物指標：根據國家標準對酸奶的大腸桿菌[17]、乳酸菌數[18]以及致病菌[19-20]等進行測定。

理化指標：根據國家標準對酸奶的酸度[21]、蛋白含量[22]、脂肪含量[23]等進行測定。

2 結果與分析

2.1 沙棘酸奶發酵工藝優化單因素試驗結果

2.1.1 沙棘汁添加量對酸奶品質的影響

沙棘汁添加量對酸奶品質的影響見圖1。由圖1可知，沙棘汁添加量對酸奶的酸度影響較小，而隨著沙棘汁添加量的增加，酸奶的感官評分呈現先增加后減小的趨勢，當沙棘汁添加量為6%時，產品口味較淡，色澤較淺，因此感官評分較低為75分；當沙棘汁添加量為12%時，產品口感、顏色及風味最佳，感官評分最高，為90分；繼續增加沙棘汁添加量則會因為沙棘味較重而掩蓋酸奶原有風味，導致感官評分降低。因此，確定最佳沙棘汁添加量為12%。

圖1 沙棘汁添加量對酸奶品質的影響Fig.1 Effect of sea-buckthorn juice addition on the quality of yoghurt

2.1.2 白砂糖添加量對酸奶品質的影響

白砂糖添加量對酸奶品質的影響見圖2。由圖2可知，白砂糖添加量對酸奶的酸度影響較小，而酸奶的感官評分隨著白砂糖添加量的增加呈現先上升后下降的趨勢。當白砂糖添加量為8%時，感官評分最高，為90分。當白砂糖添加量較小時，酸奶酸味太重，口感較差。當白砂糖添加量＞8%之后，又因甜味過重，酸奶特有香味減小，感官評分隨之降低。因此，確定最佳糖添加量為8%。

圖2 白砂糖添加量對酸奶品質的影響Fig.2 Effect of sugar addition on the quality of yoghurt

2.1.3 發酵劑添加量對酸奶品質的影響

發酵劑添加量對酸奶品質的影響見圖3。由圖3可知，隨著發酵劑添加量的增大，由于乳酸菌數量不斷增加使得酸奶酸度不斷增加，當添加量＞1.0%之后，酸奶酸度不再變化，這可能由于乳酸菌數量過多，而營養物質有限，活菌量達到最大，產酸量穩定。副干酪乳桿菌發酵沙棘酸奶的感官評分隨發酵劑添加量的升高呈現先上升后下降的趨勢。當發酵劑添加量為0.8%時，酸奶的感官評分最高，為91分。發酵劑添加量較低，酸奶成型較差，風味較淡，但添加量不斷增大后，營養物質大量消耗，酸度較大而導致酸奶風味苦澀，使得感官評分不斷降低。因此，確定最佳發酵劑添加量為0.8%。

圖3 副干酪乳桿菌添加量對酸奶品質的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus paracasei addition on the quality of yoghurt

2.2 沙棘酸奶發酵工藝優化響應面試驗結果

2.2.1 回歸模型的建立及分析

副干酪乳桿菌發酵沙棘酸奶制作工藝優化響應面試驗設計及結果見表3。

表3 沙棘酸奶發酵工藝優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface tests for sea-buckthorn yogurt fermentation process optimization

以感官評分為主要考察指標，應用Design Expert 10.0軟件對表3試驗結果進行多元回歸擬合，得到以副干酪乳桿菌發酵酸奶感官評分（Y）為響應值，與影響因素沙棘汁添加量（A）、白砂糖添加量（B）、發酵劑添加量（C）的二次回歸方程：Y=91.40-0.63A+0.12B-0.75C+0.25AB-1.00AC+0.50BC-6.83A2-3.32B2-1.58C2。對該模型進行方差分析及模型系數進行顯著性檢驗，結果見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

續表

由表4可知，模型的P值＜0.000 1，極顯著，失擬項的P值＞0.05，不顯著，表示結果與實際符合。一次項C、交互項AC及二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項A對結果影響顯著（P＜0.05），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。模型的校正決定系數R2adj=0.982 6，說明此模型與數據擬合度很高，試驗誤差小，預測結果較好。3個因素對沙棘酸奶品質影響的大小依次是C（發酵劑添加量）＞A（沙棘汁添加量）＞B（白砂糖添加量）。

2.2.2 各因素交互響應面優化分析

應用Design Expert 10.0對試驗結果進行分析，繪制響應面及等高線圖，結果見圖4。由圖4可知，沙棘汁和發酵劑添加量的交互作用等高線為橢圓形，響應面不平緩，說明沙棘汁和發酵劑添加量對沙棘酸奶感官評分的影響顯著（P＜0.05），白砂糖和沙棘汁、白砂糖和發酵劑添加量間交互作用的等高線接近圓形，響應面圖比較平緩，說明影響不顯著（P＞0.05），與方差分析結果一致。

圖4 各因素間交互作用對沙棘酸奶感官評分影響的響應面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory score

2.3 最佳工藝條件的驗證

由響應面優化得到沙棘酸奶的最優發酵工藝為沙棘汁添加量11.91%、白砂糖添加量8%、發酵劑添加量0.95%，預測的感官評分為91.49分。但是由于考慮到操作過程的可行性，將工藝條件調整為沙棘汁添加量12%、白砂糖添加量8%、發酵劑添加量1%。在此條件下進行驗證試驗，沙棘酸奶的感官評分實際值為91.33分，結果表明，響應面優化出的副干酪乳桿菌沙棘酸奶工藝參數是準確可靠的。

2.4 沙棘酸奶產品分析測定

2.4.1 感官評價

根據最優工藝條件制備的凝固型沙棘酸奶色澤呈現乳白色略帶淡黃色，口感細膩、柔和，帶有沙棘的清香，酸甜可口，組織狀態均勻，無乳清晰出，無分層現象[24]。

2.4.2 微生物指標

沙棘酸奶中未檢出大腸桿菌，乳酸菌活菌數為1.4×107CFU/mL，致病菌未檢出，均符合國家標準GB 19302—2010《食品安全國家標準發酵乳》的規定（乳酸菌活菌數≥1.0×106CFU/mL，致病菌和大腸桿菌不準檢出）[25]。

2.4.3 理化指標

沙棘酸奶的酸度為83.0°T，蛋白質含量為3.6%，脂肪含量為2.9%，均符合國家標準GB 19302—2010《食品安全國家標準發酵乳》的規定（酸度≥70.0°T、蛋白質含量≥2.3%、脂肪含量≥2.5%）[25]。

3 結論

本試驗以感官評分為響應值，采用單因素及響應面法對副干酪乳桿菌發酵沙棘酸奶的工藝進行優化，得到最優發酵工藝為沙棘汁添加量12%，白砂糖添加量8%，發酵劑添加量1%。在此優化條件下得到的沙棘酸奶呈淡黃色，具有沙棘和酸奶清香味，酸甜適中，組織細膩，穩定性好、無乳清晰出，感官評分最高，為91.33分。并且產品理化指標和微生物指標均符合國家標準GB 19302—2010《發酵乳》的相關要求。副干酪乳桿菌發酵沙棘酸奶不僅具有沙棘和乳酸菌的特有的營養和風味，同時也為研發有價值的乳制品生產提供理論指導，對沙棘深加工的研究具有重要的意義。