基于網絡藥理學的“淫羊藿-熟地黃”配伍治療骨質疏松癥作用機制研究

馮宜蒀 來積芳 董萬濤* 海云翔 王凱 張小云 滕彥橋

1.甘肅中醫藥大學附屬醫院關節外科，甘肅 蘭州 730000

2.甘肅中醫藥大學中醫臨床學院，甘肅 蘭州 730000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減低，骨組織微結構損壞，骨的脆性增加而易發生骨折為特點的常見全身性骨骼疾病[1]，中醫學屬“骨痿”“骨枯”范疇，多數醫家認為“腎虛精虧”是OP發生的主要病機。腎主骨生髓，腎虛則精血無以化生，精虧髓乏則骨骼脆性增加，痿弱難用，故而引發OP。因此，從腎論治是中醫治療OP的基本大法[2]。

淫羊藿、熟地黃始載于《神農本草經》。淫羊藿味辛、甘，性溫，歸肝、腎二經，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕等功效[3]。熟地黃味甘、性溫，功長于補，具有益精填髓、補血養陰之效[4]。兩藥相須為用是補腎陽、滋腎陰、填精髓的常用藥對，可見于經典名方贊育丹及仙靈骨葆膠囊、骨疏康顆粒等中成藥中。研究發現，熟地、淫羊藿配伍可顯著提高糖尿病大鼠下肢骨密度，增加骨中鈣、磷含量[5]。“淫羊藿-熟地”藥對成分復雜，其對OP發揮的治療作用涉及機體調控的多個生物過程和信號通路。本研究基于網絡藥理學方法，通過建立“藥對活性成分-靶點-疾病”的可視化網絡，從多成分、多靶點角度闡釋“淫羊藿-熟地”治療OP的分子機制。

1 資料與方法

1.1 軟件與數據庫

BATMAN-TCM數據庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)收集“淫羊藿-熟地”藥對化學成分；GeneCards(https:// www.Genecards.org/)、OMIM(htt ps://www.omim.org/)數據庫收集OP相關基因，Venny 2.1.0(https://bioinfo gp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線工具繪制韋恩圖，找出相關映射；STRING 11.0數據庫(https://string-db.org/)進行蛋白質相互作用分析；clusterPr ofiler R包對所獲得的共有靶點進行基因本體論(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析；Cytoscape3.7.2(https://cytoscape.org/)軟件構建網絡及數據分析。

1.2 “淫羊藿-熟地黃”藥對主要活性成分篩選及靶點預測

BATMAN-TCM數據庫具有中藥小分子研究相關靶蛋白及相關功能的特點，是一種采用邏輯回歸、“棄一法交叉驗證”構建的靶點預測工具[6]。通過BATMAN-TCM數據庫搜集“淫羊藿-熟地黃”所有化學成分，以Score cutoff≥20，P≤0.05作為篩選閾值并結合文獻報道確定最終藥物活性成分。后對有效活性成分所對應的潛在靶蛋白進行逐一搜集，得到藥物對應的潛在靶點。

1.3 OP疾病相關靶點獲取

GeneCards與OMIM數據庫是信息較為全面的疾病靶點、基因組數據庫。GeneCards數據庫可提供基因、基因與疾病關系等多種信息，OMIM數據庫含有已知的孟德爾疾病、15 000條基因信息和人類關注的表型和基因型之間的關系[7]。以“osteoporosis”為檢索詞在GeneCards數據庫及OMIM數據庫中檢索得到OP疾病相關基因，對搜集到的疾病靶點處理、去重后，得到OP相關靶點。

1.4 “淫羊藿-熟地黃”藥對治療OP的潛在靶點

利用Venny2.1.0在線工具將“藥物-靶點”與“疾病-靶點”進行映射，繪制Venny圖并得到“淫羊藿-熟地黃”藥對治療OP的作用靶點。

1.5 靶點蛋白與蛋白相互作用(PPI)網絡分析

STRING數據庫構建的蛋白質相互作用網絡具有顯示蛋白質分子間直接物理相互作用和間接功能相關性的特點[8]。將1.4中獲取的藥物治療疾病潛在靶點上傳至在線STRING 11.0 數據庫，獲取蛋白互作信息，并使用R軟件繪制互作網絡鄰接節點數目圖進行拓撲分析。

1.6 生物功能與通路富集分析

使用clusterProfiler R包對獲取的“淫羊藿-熟地黃”藥對治療OP的關鍵靶點(pvalueCutoff<0.05，qvalueCutoff<0.05)進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，探討“淫羊藿-熟地黃”藥對治療OP的相關生物過程及信號通路。

2 結果

2.1 “淫羊藿-熟地黃”藥對主要活性成分及靶點

通過BATMAN-TCM數據庫輸入復方中藥進行化合物及靶點預測(Score cutoff≥20，P≤0.05)，共獲得“淫羊藿-熟地黃”藥對中地黃苷A(Rehmannioside)、尿嘧啶核苷(Uridine)、山柰酚(Kaempferol)、木蘭花堿(Magnoflorine)等13個主要化學成分和134個蛋白靶點。

2.2 “淫羊藿-熟地黃”藥對治療OP的潛在靶點

使用Venny2.1.0在線工具將獲取的134個復方(YYHSD)靶點和3 231個OP(經OMIM和GeneCards數據庫共同篩選所得)靶點映射后得到共同靶基因57個，結果見圖1。

圖1 成分靶點-疾病靶點維恩圖

2.3 蛋白互作網絡

利用String軟件對上述57個交集靶點構建蛋白相互作用網絡。使用R軟件繪制互作網絡鄰接節點數目圖，鄰接節點數目越多表示該基因處在蛋白互作網絡核心位置，對整個網絡起關鍵作用(圖2)。由圖3柱狀圖可以看出，前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、雄激素受體(AR)、雌激素受體1(ESR1)、細胞色素P450c17a(CYP17A1)、芳香化酶(CYP19A1)等可能是“淫羊藿-熟地黃”藥對治療OP的核心靶點。

圖2 互作網絡鄰接節點數目

圖3 蛋白相互作用網絡圖

2.4 “淫羊藿-熟地黃”藥對治療OP的GO富集分析

使用clusterProfiler R包對2.2中所獲取的57個“淫羊藿-熟地黃”藥對治療OP的潛在靶點進行GO功能富集分析。從生物過程(biological process，BP)、細胞成分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)3個層面對關鍵靶點進行不同生物學過程分析，依據P<0.05列出排名靠前的GO富集分析結果，包含單胺類運輸(monoamine transport)、血液循環(blood circulation)、G蛋白偶聯受體信號途徑(G protein-coupled receptor signaling pathway)等生物過程；軸突部分(axon part)、神經元細胞體(neuronal cell body)、軸突終末(axon terminus)等細胞成分；黃素腺嘌呤二核苷酸結合(flavin adenine dinucleotide binding)、G蛋白偶聯胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)等分子功能。見圖4、5。

圖4 GO富集結果柱狀圖

圖5 GO富集結果氣泡圖

2.5 “淫羊藿-熟地黃”藥對治療OP的KEGG通路分析

使用clusterProfiler R包對2.2中所獲取的57個靶點進行KEGG通路富集分析，確定了11條主要信號通路，包括神經活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、類固醇激素的合成(steroid hormone biosynthesis)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)等，涉及代謝、炎癥、免疫、激素合成等多個方面，見表1、圖6。

表1 KEGG通路分析

圖6 KEGG富集結果柱狀圖

2.6 構建“藥物-活性成分-OP-作用靶點”網絡

將OP和“淫羊藿-熟地黃”復方(YYHSD)獲得的57個靶點，整理出“藥物-活性成分-OP-作用靶點”交集網絡，獲得135對關系對數據，72個節點。使用Cytoscape 3.7.2軟件進行圖形可視化(圖7)。紅色六邊形代表骨質疏松癥，藍色四邊形代表中藥，黃色三角形代表化合物，綠色圓形代表靶點。

圖7 YYHSD-骨質疏松癥-化合物-靶點網絡圖

3 討論

單味中藥及復方治療原發性骨質疏松癥具有整體調節、副作用小、療效確切等優勢[9]，通過作用于不同的器官或組織，可在多層面、多途徑、多靶點上發揮補腎益精強骨之功。本研究基于網絡藥理學方法，從藥物、疾病兩方面分析了“淫羊藿-熟地黃”藥對有效成分，篩選出“淫羊藿-熟地黃”藥對治療OP的潛在靶點，并對其中的關鍵靶點進行了功能富集和信號通路富集分析。

結果表明，地黃苷A、梓醇、山柰酚等是“淫羊藿-熟地黃”藥對中抗OP的主要成分。熟地黃主要活性成分環烯醚萜苷主含地黃苷A及梓醇等成分[10]，地黃苷A能夠增加骨髓有核細胞數和DNA含量，促進粒細胞增殖，亦可通過刺激B淋巴細胞和T淋巴細胞增強體液免疫和細胞免疫功能[11-12]。由此推斷，地黃苷A對OP發揮治療作用可能與其促進骨髓細胞增殖及增強免疫有關。OP引起骨髓微環境病理改變，影響骨髓間充質干細胞(MSCs)增殖與遷移，促進其凋亡，這使得OP時正常MSCs難以分化為成骨細胞來修復受損骨組織[13]。骨系統和免疫系統間存在密切聯系，OP的發生使T細胞被激活，活化的T細胞分泌 TNF-α、白介素-1(IL-1)和白介素-6(IL-6)，進一步刺激核因子κB受體活化因子配體(RANKL)表達，從而激活破骨細胞的活性，導致骨質疏松加重[14]。梓醇可通過促進成骨細胞的增殖、分化及骨形成調節骨代謝[15-16]，亦可上調BMP2、RUNX2和Osteriex等調節成骨細胞形成、分化關鍵因子的表達，增加MC3T3-E1成骨細胞的增殖，提高成骨細胞堿性磷酸酶活性(ALP)及增加骨橋蛋白，從而促進成骨細胞的分化[17]。山奈酚可顯著增加早期和晚期成骨參數，包括堿性磷酸酶(ALP)活性、膠原合成、Runx2、osterix、骨橋蛋白和骨唾液蛋白mRNA表達水平。通過刺激雌激素信號傳導，進而激活WNT信號傳導途徑，實現其潛在的護骨作用[18]。

通過PPI網絡構建及撲分析后發現PTGS2、AR、ESR1、CYP19A1等可能是藥物發揮治療作用的核心靶點。前列腺素內過氧化物合酶(PTGS)又稱環氧合酶(COX)，COX-1和COX-2是其兩個亞型。研究證實，在誘導骨細胞信號轉導方面，COX-2表達誘導產生前列腺素E2(PGE2)可降低顱骨細胞培養基中成骨細胞的分化，通過破壞COX-2的基因可促進大鼠顱骨細胞中成骨細胞的增殖[19]。另有研究表明，去勢大鼠的骨組織中COX-2表達增強，通過抑制COX-2的表達，可減低破骨細胞的分化[20-21]。雄激素調節骨代謝依賴AR介導，AR在MSCs、成骨、破骨細胞及骨細胞中均有明顯表達，其主要通過促進MSCs向成骨細胞分化，促進成骨細胞骨化、礦化以及抑制破骨細胞分化等方式進行，調控機制與Wnt/β-catenin、MAPK、BMP/SmadsRunx2等通路有關[22]。ESR是一類配體活化的轉錄因子，包括ESR1和ESR2。ESR1與中國絕經后婦女的骨折發生風險存在相關性[23]，ESR1調節骨代謝可能通過轉化生長因子β(TGF-β)途徑和抑制IL-6的活動來發揮雌激素激動劑樣作用[24-25]。芳香化酶抑制劑(AIs)可通過抑制外周組織CYP19A1活性以降低循環血中的雌激素水平，導致人體骨密度減低，骨量丟失嚴重[26]。這提示CYP19A1可能是“淫羊藿-熟地黃”藥對發揮作用的主要靶點，為“淫羊藿-熟地黃”藥對治療OP的分子作用基礎給出了新的預測，為進一步驗證提供了新的線索。

在GO通路富集和KEGG通路富集分析結果中，“淫羊藿-熟地黃”藥對能夠調節血液循環、細胞鈣離子穩態、G蛋白偶聯胺受體活性等生物功能，亦可調控cAMP信號通路、類固醇激素的合成、神經活性配體-受體相互作用等。血液循環在OP的發生、發展變化過程中起著重要作用。Qiu等[27]探討血液循環與骨密度丟失關系的研究中發現，血紅蛋白與OP的發生有關，其水平的高低與骨密度呈正相關，提示可能與促紅細胞生成素(EPO)在骨重建中的作用、組織缺氧、酸性物質堆積等因素相關[28-29]。細胞內游離的Ca2+([Ca2+]i)具有第一信使的作用，可參與調控成骨細胞的骨形成，并在維持骨代謝動態平衡方面發揮著重要作用[30-31]。cAMP是細胞內重要的第二信使，淫羊藿苷通過激活cAMP/蛋白激酶A(PKA)/cAMP反應元件結合蛋白(CREB)途徑促進成骨細胞的成骨，通過提高細胞內cAMP水平和促進PKA和CREB磷酸化激活成骨細胞的cAMP/PKA/CREB信號轉導。用cAMP合成腺苷酸環化酶(AC)抑制劑和PKA抑制劑阻斷cAMP/PKA/CREB信號傳導，可明顯抑制淫羊藿苷對成骨細胞的成骨作用[32]。目前尚無神經活性配體-受體相互作用和OP的相關報道，但神經-內分泌-免疫(NEI)網絡學說認為，神經系統、內分泌系統及免疫系統共同調控機體內環境的穩態，這主要依靠各種神經遞質、細胞因子、激素等作為介質發揮協同作用。NEI網絡可通過下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)實現對OP的免疫調節作用[33-34]。

綜上，利用網絡藥理學可預測“淫羊藿-熟地黃”藥對治療OP的潛在靶點、生物學過程及信號通路，揭示其治療OP的作用機制，對今后開展相關生物學實驗驗證提供了參考和依據。但網絡藥理學研究疾病靶點數據庫主要通過現代醫學疾病名稱進行檢索，本研究對骨質疏松癥具體證型未進行細化探討。后期的研究中需對疾病及其分型進行深入探索，以辨證為綱，進一步理解病與證間的內在聯系，對基礎實驗和中醫臨床證候進行有效整合，構建病證結合網絡模型，為病證結合研究提供新的思路與方法。