氫氣對蛛網膜下腔出血致急性腎損傷大鼠的保護作用

宋京花，賈紅艷，邵天鵬，柳志寶，趙元平

(河北省滄州市中心醫院放射介入科，河北 滄州 061000)

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是最常見的腦血管意外之一，致死致殘率較高[1]。既往研究表明，SAH患者1周內的全因病死率高達40%[2]。除疾病本身外，SAH的并發癥也是導致其不良預后的重要因素。急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)作為SAH患者常見的嚴重并發癥之一，可顯著增加SAH患者的病死率，因此，如何改善SAH合并AKI患者的腎臟功能是急需解決的醫學難題之一[3]。氫氣作為一種選擇性抗氧化劑，具有易穿透細胞膜，可以作用于亞細胞結構，通過參與多種信號通路的調控，選擇性清除機體內氧自由基的特點[4]。既往研究表明，氫氣能選擇性的清除的·OH和ONOO-等能導致細胞損傷的強氧化劑，從而產生抗炎，抗凋亡的作用[5]。已有研究證實，吸入低濃度氫氣能減輕SAH大鼠神經元損傷，減輕局灶性腦缺血再灌注損傷[6]。但關于氫氣對于SAH導致的遠隔器官損傷的保護作用尚不明確，本研究旨在探討氫氣對SAH致大鼠AKI的腎臟功能的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1一般資料 53只SPF級Sprague Dawley雄性大鼠，8～9周齡，體重300～350 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司(SYXK(京)2012-0036)。所有大鼠飼養于動物房，室溫維持在(25±1) ℃，濕度維持(55±5)%，光照/黑暗周期為12 h/12 h。所有大鼠手術前均分籠適應性飼養1周，所有大鼠在實驗過程中均參考國家衛生研究院發布的《實驗動物護理和使用指南》的建議接受人類護理。

1.2主要設備與試劑 七氟醚購于上海恒瑞醫藥有限公司；甘露醇購于華仁藥業(日照)有限公司；造影劑購于江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；ROS試劑盒，苯甲基磺酰氟，裂解液，bak兔多抗，caspase-3單克隆抗體，原位末端標記法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)試劑盒，PVDF膜，SDS-PAGE凝膠，預染彩虹maker，溴酚蘭，QuickBlock封閉液，TBS-T，超敏ECL發光液，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)均購于上海碧云天科技有限公司；蘇木素，伊紅染液購于珠海貝索生物技術有限公司；bcl-2兔多抗購于北京索萊寶科技有限公司；電泳槽購于北京君意東方電泳設備有限公司，型號：JV-ZY6；脫色搖床購于泰州諾米醫療科技有限公司，型號：NYC-80；多功能手術儀(雙極電凝)購于武漢春光醫療美容儀器有限公司，型號：CHR-V；小動物麻醉機購于ABM；體溫維持儀購于上海玉妍科學儀器有限公司，型號：XMTF-7000；離心機購于湖南安君研儀器有限公司，型號：A16K-R；酶標分析儀購于南京德鐵實驗設備有限公司，型號：HBS-1096B；熒光顯鏡購于廣州市明美光電技術有限公司，型號：MF43。

1.3動物實驗

1.3.1模型制備及驗證 采用大鼠頸內動脈穿刺，輸注甘露醇和造影劑的方法制備SAH致AKI模型。將大鼠置入預充七氟醚的麻醉箱進行麻醉誘導，待麻醉滿意后仰臥位固定于鋪有溫毯的操作臺上，設置肛溫<38 ℃時溫毯加熱，3%～4%七氟醚麻醉維持。在模型制備前經鼠尾靜脈采集血液測定血肌酐(serum creatinine，SCr)(0 h SCr)，備皮、消毒、鋪巾，正中切口，逐層分離，暴露左頸動脈，結扎離斷頸外動脈分支并電凝止血。無損傷血管鉗夾閉頸總動脈，頸內動脈。結扎頸外動脈遠端并切開拉直，使得其與頸內動脈呈一直線。從頸外動脈將頭端磨銳的尼龍線置入，直至有阻力感繼續置入3 mm左右，刺破頸內動脈顱內段(20±2) mm，造成SAH，隨后撤出尼龍線，結扎頸外動脈近心端，開放頸總動脈，縫合切口，并給予0.25%羅哌卡因局部封閉鎮痛。隨后從鼠尾靜脈分別緩慢靜注甘露醇9 g/kg，注入造影劑2 mL。對照組模型除不刺破大腦中動脈血管其余操作均相同。所有大鼠均回籠單獨飼養。模型制備后24 h(24 h SCr)經鼠尾靜脈采集血液測定SCr。24 h SCr>1.5×0 h SCr認為SAH致大鼠AKI模型制備成功。

1.3.2實驗分組 制備對照組12只，無死亡；制備SAH致AKI模型使用大鼠41只，死亡8只，SAH致AKI模型(24 h SCr>1.5×0 h SCr)成功24只，隨機分為模型組(n=12)和氫氣治療組(n=12)。制備模型成功后24 h和48 h時，將氫氣治療組大鼠置入預充2.9%濃度氫氣的麻醉誘導箱中2 h，將模型組和對照組大鼠置入預充空氣的誘導箱2 h。

1.3.3AKI血清學參數分析 各組大鼠在組織灌注前，從主動脈采集血樣0.7～1.0 mL，測定BUN和SCr水平。

1.3.4蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)測定大鼠腎臟病理改變 模型制備成功后72 h，在6%七氟醚深度麻醉下，迅速去除胸骨打開胸腔，充分暴露心臟，于心尖處取血2 mL，隨后使用連接輸液器的穿刺針從心尖部位插入，向上進針到升主動脈并使用血管鉗固定。剪開右心耳后使用生理鹽水灌注，直至肝，腎和肺臟顏色轉白，右心耳流出的液體清亮后，灌注10%甲醛250 mL，摘取右腎(n=6)。經固定、脫水、透明、浸臘、包埋后，切制5 μm石蠟切片。經二甲苯Ⅰ、Ⅱ分別浸泡10 min后，不同濃度梯度酒精(100%，90%，80%，70%)脫蠟，各2 min，隨后置入蘇木素染液中染色6 min，水化30 min后置入伊紅染色液中染色3 min，水洗2 min后置入不同濃度梯度酒精(70%、80%、90%、100%)脫水，各30 s，再放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中分別透明10 min，滴加中性樹膠后封片，觀察。腎臟病理評分依據Paller評分法：即每高倍鏡視野隨機選擇10個有病變的腎小管，按100個腎小管記分，腎小管明顯擴張、細胞扁平記1分；刷狀緣損1分，脫落記2分；腎小管管腔內有脫落的、壞死的細胞包括未成管型或細胞碎片記1分，管型記2分。

1.3.5腎臟組織活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的測定 模型制備成功后72 h，在8%七氟醚麻醉下摘取右腎，將0.1 mL含1 mg腎臟皮質組織、2.9 mL ROS分析介質和15 nmol/L 2′，7′-二氯氟二乙酸混勻后，在37 ℃溫箱中孵育15 min，酶標儀測定488 nm激發波長，525 nm發射波長下的熒光值。

1.3.6蛋白印跡法測定大鼠腎臟組織B淋巴細胞瘤2 (B-cell lymphoma-2,bcl-2)、bcl-2相關蛋k(bcl-2 associated-k,bak)以及裂解的半胱氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)蛋白表達 模型制備成功后72 h，每組取6只大鼠的腎臟組織100 mg(n=6)。充分剪碎、研磨組織，加入500 μL苯甲基磺酰氟和500 μL裂解液進行組織勻漿，在4 ℃，12 000 r/min，半徑=8 cm條件下離心5 min，取上清采用二喹啉甲酸法測定蛋白含量。計算含30 μg蛋白的溶液體積即為上樣量，加入上樣緩沖液后于水中煮沸5 min至蛋白變性，加入10% SDS-PAGE凝膠上樣孔中，恒壓80 V電泳至預染彩虹預染蛋白分離清晰，溴酚蘭即將跑出凝膠。隨后采用80 V恒壓濕轉50 min，將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜，隨后移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h。TBS-T緩沖液洗滌聚偏二氟乙烯膜后，分別加入bcl-2(1∶1 000)，bak(1∶1 000)，caspase-3(1∶1 000)一抗，4 ℃過夜。TBS-T洗膜3次，每次5 min。加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(1∶1 000)室溫下孵育1 h。TBS-T緩沖液洗膜3次每次5 min。加入ECL發光液，在脫色搖床上反應5 min，發光儀顯影。GAPDH作為內參蛋白，以目的蛋白與內參蛋白條帶的灰度比值表示蛋白表達水平。

1.3.7免疫熒光法測定大鼠腎臟細胞凋亡率 每組取6只大鼠的腎臟石蠟切片(n=6)，在二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡10 min以及不同濃度梯度酒精(100%、90%、80%、70%)脫蠟后，置于裝有PBS的染色缸中洗片3次，每次5 min。滴加20 μL不含DNase的蛋白酶K，于37 ℃溫箱中孵育反應35 min，置于裝有PBS的染色缸中洗片3次，每次5 min。隨后加入TUNEL檢測液，在37 ℃溫箱中避光孵育60 min，置于裝有PBS的染色缸中洗片3次，每次5 min，滴加含DAPI的封片液，蓋玻片封片，熒光顯微鏡下進行觀察。計算TUNEL/DAPI雙陽性細胞數占總細胞的百分比即為細胞凋亡率，計數5個高倍視野取平均值。

1.4細胞實驗

1.4.1腎小管上皮細胞的培養及分組 腎小管上皮細胞系NRK52E用含10%胎牛血清的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2恒溫箱培養，每天換液1次，待細胞融和至90%，加入胰蛋白酶進行消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗；模型組用300 μmol/L過氧化氫干預24 h建立氧化應激損傷模型，氫氣治療組在過氧化氫干預后24 h和48 h分別給予2.9%氫氣處理2 h。

1.4.2腎小管上皮細胞丙二醛(malonaldehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定 待細胞干預結束后取各組細胞培養基1 mL，按照試劑盒說明書要求處理樣品，硫代巴比妥酸法檢測MDA，黃嘌呤氧化法檢測SOD，按照試劑盒步驟操作。每次設3個復孔，重復3次。

1.4.3流式細胞儀檢測腎小管上皮細胞凋亡水平 各組細胞干預后培養2 d，添加0.25%胰蛋白酶后收集各組細胞，用150 μL緩沖液將各組細胞懸浮，添加Annexin V-FITC約10 μL后，避光孵育15 min。添加5 μL PI均勻混合，繼續添加150 μL緩沖液，立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，每次設3個復孔，重復3次。

1.4.4四甲基偶氮唑藍(Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT)法檢測細胞存活率 各組細胞接種于96孔板上，每孔避光加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續孵育 4 h。棄去培養液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，于微量振蕩器上水平緩慢振蕩1 min，待充分結晶沉淀后，用酶聯檢測儀檢測波長570 nm處的吸光度(optical delnsity，OD)值，計算存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.5統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用單因素方差分析和Tukey檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1氫氣治療對大鼠BUN和SCr水平的影響 模型組和氫氣治療組大鼠BUN和SCr水平高于對照組，氫氣治療組大鼠BUN和SCr水平低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠BUN和SCr水平比較Table 1 Comparison of blood urea nitrogen and serum creatinine of rats in each group

2.2氫氣治療對大鼠腎臟病理改變的影響 HE染色結果顯示：對照組大鼠腎臟組織結構清晰，細胞排列緊密，細胞核及細胞質染色均勻，僅見少量腎小管上皮細胞刷狀緣。模型組大鼠腎臟組織可見大量小管上皮細胞腫脹、顆粒及空泡變性；部分小管上皮細胞刷狀緣、扁平、皺縮、脫落、核深染、裸露，嚴重部位見彌漫性細胞片狀崩解、壞死，脫落，基底膜不完整；部分腎小管管腔擴張，管腔內可見上皮細胞碎片，腎間質水腫，充血及出血明顯。氫氣治療組組織腎小管腫脹、充血、出血及細胞核脫落情況明顯減輕(圖1)。模型組和氫氣治療組大鼠腎小管損傷評分高于對照組，氫氣治療組大鼠腎小管損傷評分低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色(×100)

表2 各組大鼠腎小管損傷評分比較Table 2 Comparison of renal tubular injury of rats in each group 分)

2.3氫氣治療對大鼠腎臟組織中ROS水平的影響 模型組和氫氣治療組大鼠腎臟組織中ROS水平高于對照組，氫氣治療組大鼠腎臟組織中ROS水平低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腎臟組織ROS水平比較Table 3 The content of ROS in the renal tissue of rats in each group

2.4氫氣治療對大鼠腎臟組織中bcl-2、bak和cleaved caspase-3蛋白表達的影響 模型組和氫氣治療組大鼠腎臟組織bcl-2/bak蛋白比值低于對照組，cleaved caspase-3蛋白表達高于對照組；氫氣治療組大鼠腎臟組織bcl-2/bak蛋白比值高于模型組，cleaved caspase-3蛋白表達低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 各組大鼠腎臟組織bcl-2、bak、cleaved caspase-3和內參的蛋白印記

表4 各組大鼠腎臟組織bcl-2/bak比值和cleaved caspase-3蛋白表達比較Table 4 Comparison of bcl-2/bak ratio and cleaved caspase-3 expressions in the renal tissue of rats in each group

2.5氫氣治療對大鼠腎臟細胞凋亡率的影響 模型組和氫氣治療組大鼠腎臟細胞凋亡率高于對照組，氫氣治療組大鼠腎臟細胞凋亡率低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠腎臟細胞凋亡率比較Table 5 Apoptotic rate of renal cells of rats in each group

2.6氫氣治療對氧化應激腎小管上皮細胞MDA、SOD、存活率和凋亡率的影響 模型組和氫氣治療組腎小管上皮細胞MDA水平和凋亡率高于對照組，SOD水平和存活率低于對照組；氫氣治療組腎小管上皮細胞MDA和凋亡率低于模型組，SOD和存活率高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 各組腎小管上皮細胞MDA、SOD、凋亡率和存活率比較Table 6 Comparison of malondialdehyde,superoxide dismutase,apoptotic rate,and survival rate of tubular epithelial cells in each group

3 討 論

SAH是一種嚴重威脅人類生命健康的急危重癥，其中85%出血原因為顱內動脈瘤破裂，臨床上主要表現為顱內壓升高、患者意識減退甚至消失[7]。目前認為早期腦損傷是SAH致死致殘的主要原因，其病理生理機制主要包括動脈瘤破裂后的機械性損傷、顱內壓升高、腦血流量降低、腦灌注壓下降、大腦皮質廣泛去極化、細胞凋亡和壞死自噬作用、離子穩態破壞、炎癥反應、血腦屏障破壞等[8-10]。早期腦損傷在損傷神經功能的同時，也導致了全身應激反應、炎癥反應以及神經體液改變等，進而導致心臟、肺、腎及胃腸道等遠隔器官的損傷[11-12]。甘露醇作為降低顱內壓既經濟又有效的藥物，常應用于SAH患者，造影劑是SAH介入診斷及治療的必備藥，兩者的應用均可加重腎臟負擔。本研究參考文獻[13]通過頸外動脈置管，經頸內動脈刺破大腦中動脈，制備SAH模型，并在造模成功后經鼠尾靜脈給予甘露醇及造影劑，模擬了SAH患者的入院診治過程，將24 h SCr高于1.5倍基礎 SCr定為AKI。本研究結果表明，SAH大鼠應用造影劑及甘露醇后，腎功能受損，AKI發生率約為70%，提示SAH誘發的大鼠AKI模型建立成功。

既往研究表明，SAH早期誘發的兒茶酚胺大量釋放，導致外周器官缺血缺氧，并誘發多種炎性因子活化；SAH可誘發腦血管痙攣，缺氧后的腦組織造成線粒體能量耗竭，多種氧離子及過氧化氫生成，血腦屏障完整性下降，炎性因子及氧自由基釋放入血，進一步加重全身炎性反應[14]。腎臟作為血流量最大的外周遠隔器官之一，SAH誘發的AKI是臨床中最為常見的并發癥之一，已有研究表明，SAH誘發的AKI可能與小管上皮細胞氧化應激、炎癥反應，進一步誘導腎小管上皮細胞凋亡反應有關[15]。線粒體作為氧化應激反應的主要靶點，缺血再灌注損傷可導致ROS水平急劇升高，誘導凋亡因子bak活化，導致線粒體外膜通透性增強，進而誘發細胞凋亡；bcl-2作為最重要的抗凋亡因子，通過抑制bak活化，保持線粒體膜完整性，抑制細胞凋亡[16]。既往研究表明，bcl-2/bak比值的改變可調控細胞凋亡，bcl-2/bak比值下調，表明細胞正在發生凋亡[17]。caspase-3作為凋亡級聯反應的最后一級，活化后裂解為cleaved caspase-3，通過進入細胞核切割DNA，誘發細胞凋亡[17]。本研究結果顯示，SAH后大鼠腎臟組織ROS水平升高，bcl-2/bak比值下調，cleaved caspase-3表達上調，腎臟組織細胞凋亡率升高，SCr、BUN及腎損傷評分升高，提示了SAH相關性AKI與氧化應激后誘發腎小管上皮細胞凋亡相關。

氫氣作為一種無色無味不易溶于水的氣體，近年來被發現其具有強大的抗氧化作用；與其它吸入性治療藥物比較，具有易擴散、起效快、無明顯不良反應等優點[18]。Jiang等[19]報道，吸入2%氫氣能選擇性清除·OH和ONOO-，減輕腦缺血再灌注引起的氧化應激損傷；Kumagai等[20]研究表明，氫氣通過抑制線粒體生成過氧化物，顯著減輕SAH誘發的神經細胞凋亡。本研究通過模擬SAH誘發的AKI型，在SAH后24 h、48 h時吸入2.9%氫氣2 h進行治療，結果顯示，氫氣治療組SCr、BUN及損傷評分減低，表明氫氣對SAH誘發的AKI具有保護作用；氫氣顯著減少了腎組織中的ROS含量，bcl-2/bak比值上調，腎臟細胞凋亡率降低，cleaved caspase-3表達下調，表明，氫氣對SAH誘發AKI的保護作用與減輕氧化應激，抑制腎細胞凋亡相關。

為了進一步證實氫氣對SAH誘發AKI的保護作用，本研究采用過氧化氫處理腎小管上皮細胞的體外模型，結果顯示，與單純過氧化氫處理腎小管上皮細胞比較，氫氣可顯著降低過氧化氫處理的腎小管上皮細胞中的MDA水平，并增加SOD水平，同時腎小管上皮細胞凋亡率顯著降低。表明氫氣減輕SAH誘發AKI的機制與其抑制氧化應激減少腎小管上皮細胞凋亡相關，與Ming等[21]的研究結果一致。

綜上所述，氫氣對SAH致AKI大鼠具有保護作用，其機制與氫氣能減少ROS產生，減少氧化應激，上調bcl-2/bak比值從而抑制腎臟細胞凋亡有關。