海藻酸鈉的可控分子質量高效非均相降解

楊英歌，黃繼翔，李榮

1(徐州生物工程職業技術學院 藥品食品學院，江蘇 徐州，221006)2(菏澤高新區優科生物科技有限公司，山東 菏澤，274000) 3(山東省城市服務技師學院 西餐學院，山東 煙臺，264670)

海藻酸鈉是從褐藻等海藻中提取的，由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸單體組成的天然多糖，其降解產物海藻酸鈉寡糖具有多種功能，在醫療保健領域，海藻酸鈉寡糖具有免疫調節[1-2]、促進細胞生長[3-4]、保護神經細胞并促進β-淀粉樣蛋白降解[5]、緩解藥物毒性[6]、改善骨骼退化[7]等作用；在農業領域，可提高植物抗病性[8-9]、采后保鮮[10]、促進動植物生長[11-12]等，是一種應用前景非常廣泛的寡糖。目前海藻酸鈉的降解方法主要有輻照法[13-14]和微生物酶解法[15-20]，輻照法需要Co60等輻照源，不便于推廣。酶解法條件溫和、環保壓力小且可獲得不同結構和特性的寡糖，是近年來的研究熱點。酶解法需要將海藻酸鈉溶于水中配制為均相溶液，多糖溶液黏度與濃度一般呈指數關系，黏度隨濃度提高而迅速增加；受限于黏度的增加，為滿足攪拌、泵送等工藝操作而難以進一步提高體系中的多糖濃度，導致體系降解效率較低，在酶解法研究報道中海藻酸鈉濃度均未超過1.0%(質量分數)，實際應用中海藻酸鈉具體濃度尚未見報道。降解后體系中大量水的去除一般使用蒸發或膜處理，存在能耗較高、耗時較長、膜元件通量衰減等問題。使用不能溶解多糖的液體作為介質，即非均相降解，可改善或解決水相中降解不足的問題。在非均相體系中，多糖粉末以固體微粒的形式分散在液體介質中，在整個降解過程中體系為固/液兩相狀態(圖1)，由于多糖糖鏈沒有伸展，因此多糖濃度的提高對體系黏度影響較小，在設備攪拌能力范圍內可盡量提高多糖濃度以提高生產效率；降解完畢后通過簡單的固液分離操作即可得到降解產物，無需除去水，可簡化工藝、減少能耗。在非均相體系液體介質的選擇上，前期研究發現若干低共熔溶劑(deep eutectic solvents，DES)[21-23]可滿足要求。低共熔溶劑是一類新型溶劑體系，使用膽堿、甘油、尿素、有機酸、糖類等天然成分配制的天然DES[24-25]具有綠色來源、成本低廉、可生物降解、環境友好等優點。天然DES的多糖非均相降解具有綠色環保、成本低廉、操作簡便等優勢，是一種具有良好工業化前景的多糖降解方法。因此，本文對海藻酸鈉在該體系中的降解進行了初步研究，以期為其后續研究提供參考。

a-多糖(固體微粒)；b-水相體系多糖糖鏈伸展使體系黏度較高；c-非均相體系糖鏈未伸展，體系黏度相對較低； d-攪拌中的非均相體系；e-停止攪拌的非均相體系上部為液體介質，下部白色沉淀為多糖粉末圖1 非均相體系示意圖Fig.1 Schematic diagram of heterogeneous system

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.2.1 主要材料

海藻酸鈉食品添加劑級，外觀為白色粉末，青島明月海藻集團；PRD-6DES液體，由膽堿/尿素/糖醇組成、催化劑PRD-62C、二元羧酸類催化劑，菏澤高新區優科生物科技有限公司；無水乙醇、硝酸鈉等試劑均為分析純或色譜級；水溶液配制均使用雙蒸水。

1.2.1 主要設備

85-2單數顯恒溫磁力攪拌器，金壇市城東新瑞儀器廠；NDJ-5S數顯黏度計(配0～4號轉子)，上海邦西儀器科技有限公司；Nicolet iN10傅立葉變換顯微紅外光譜儀，美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海藻酸鈉降解處理

50 g海藻酸鈉粉末與DES液體200 mL混合后加入特定比例的降解催化劑，室溫下100 r/min攪拌30 min待催化劑溶解后，轉移到特定溫度恒溫水浴中繼續攪拌一定時間進行降解處理。降解結束后使用定性濾紙在布氏漏斗上真空抽濾，濾餅在200 mL 75%(體積分數)乙醇中打漿洗滌1次后再次抽濾，濾餅在60 ℃下熱風干燥16 h，得到降解產物，用于后續檢測。

1.2.2 黏度測定

海藻酸鈉及其降解產物配制為3%(質量分數)水溶液，25 ℃下使用數顯黏度計測量黏度，每個樣品測5次取平均值。

1.2.3 分子質量測定

使用凝膠色譜-示差-多角度激光光散射(GPC-RI-MALS)分析方法，流動相為0.1 mol/L NaNO3，檢測器為Optilab T-rEX和DAWN HELEOS Ⅱ(Wyatt technology，美國)串聯使用，流速0.4 mL/min，柱溫45 ℃，分析柱為Ohpak SB-805 HQ(300 mm×8 mm)， SB-804 HQ(300 mm×8 mm)， SB-803 HQ(300 mm×8 mm)串聯使用。5 mg樣品加1 mL 流動相，45 ℃下振蕩溶解后14 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液進行上樣檢測。

1.2.4 紅外光譜檢測

待測樣品進行溴化鉀壓片后使用Nicolet iN10 傅立葉變換顯微紅外光譜儀檢測，樣品和背景掃描次數32，分辨率4 cm-1，掃描范圍4 000～400 cm-1。

1.2.4 表面掃描電鏡觀察

由上海微譜化工技術服務有限公司進行，樣品粉末黏附在導電膠表面后放入場發射掃描電鏡，加速電壓3.00 kV，觀察成像。

2 結果與分析

2.1 降解工藝優化

多糖的分子質量可通過凝膠過濾等方法獲得相對準確的測量結果，但成本和時間耗費較多，黏度法操作簡便但測量誤差較大，僅能作為分子質量的近似表示。在本研究中將黏度法和凝膠過濾法結合使用以簡便試驗過程。

2.1.1 單因素考察

為初步判斷各因素對海藻酸鈉降解的影響，對降解溫度(40～70 ℃)、催化劑用量(0.03～0.06 g催化劑/g海藻酸鈉)、降解時間(1～4 h)在固定另外2個因素(時間2 h、溫度50 ℃、催化劑用量0.04 g/g海藻酸鈉)下分別進行單因素試驗并測量降解產物黏度。隨各因素數值增加，海藻酸鈉降解產物黏度均呈下降趨勢(圖2)，未處理海藻酸鈉3%溶液黏度為7 520 mPa·s，降解后黏度最低已降至70～90 mPa·s，從圖中斜率分析認為仍存在繼續優化的空間。

a-溫度對黏度的影響；b-催化劑用量對黏度的影響；c-降解時間對黏度的影響圖2 溫度、催化劑用量、時間對降解產物黏度的影響Fig.2 Effects of temperature, catalyst dosage and time on the viscosity of degradation products

2.1.2 降解參數的Box-Behnken 優化

采用Box-Behnken 法進行試驗設計并測量降解產物黏度，結果見表1。為避免模型中黏度出現負值，對黏度結果開方變換后進行擬合，黏度(Y)與各因素編碼值的擬合方程如公式(1)所示：Sqrt(Y)=2.731 7-0.460 67A-1.775 0B-1.266 9C+0.660 3AB+0.058 54AC+0.684 1BC+0.072 32A2+1.436 6B2+0.418 0C2

表1 Box-Behnken法試驗設計及黏度測定結果Table 1 The Box-Behnken design experimental and response values for the viscosity

(1)

式中:A代表時間，h；B代表溫度，℃；C代表催化劑用量，g/g。

方差分析見表2，擬合方程F-value為28.308 8，P-value為0.000 1表明擬合極顯著，Lack of Fit值為199.6 95 6，P-value<0.000 1表明擬合誤差幾乎全部來自試驗數據而環境噪聲影響可忽略不計。從模型可知，影響黏度下降的因素重要程度依次為降解溫度、催化劑用量和降解時間，且降解溫度與催化劑用量、降解溫度與降解時間存在顯著交互作用，降解時間與催化劑用量間交互作用不顯著，因素間兩兩作用的等高線圖見圖3。公式(1)給出的理論最優值為時間5 h、溫度61.53 ℃，催化劑用量1.0 g/10g海藻酸鈉，預測黏度為2.31 mPa·s，在該條件下所得海藻酸鈉降解產物的3.0%溶液實測黏度為3.54 mPa·s。

表2 方差分析結果Table 2 The ANOVA for response surface quadratic model obtained from experimental results

2.2 分子質量測定與驗證

選擇不同黏度的海藻酸鈉降解產物，使用凝膠色譜-示差-多角度激光光散射分析方法測定分子質量，結果見表3，部分樣品的示差檢測譜圖見圖4。降解前數均分子質量為198.6 kDa，通過控制降解條件可獲得數均分子質量15.4 kDa～112.4 kDa的降解產物。反映分子質量分布寬度的多分散指數隨分子質量降低而升高，表明隨降解程度加大，分子質量分散性也隨之增加。黏度的開方數值與數均分子質量、重均分子質量、峰值分子質量均有良好相關性，在線性、指數、二次多項式模型中的R2分別為0.965 5～0.986 2、0.939 1～0.945 7、0.988 1～0.998 1，提示在取值范圍內可根據黏度對分子質量進行估計。將降解參數-黏度模型與分子質量-黏度模型聯立，從數均分子質量理論值出發推算黏度和降解參數，在模型的數均分子量范圍(15.4 kDa～60.8 kDa)內對數均分子質量理論值為30 kDa、50 kDa的降解參數進行驗證(表4)，實測值與理論值僅相差2 kDa，確認了模型的有效性，表明可通過控制降解條件獲得特定分子質量的海藻酸鈉降解產物。另外根據單因素試驗結果，對數均分子質量理論值為80 kDa、100 kDa的降解參數進行驗證(表4)，數均分子質量理論值和實測值相差約6 kDa，但黏度值的理論值和實測值相差較大，可進一步優化以提高該分子質量范圍內的預測精度。

表4 黏度-分子質量-降解參數的驗證Table 4 Verification of viscosity-molecular weight-degradation parameters

a-時間、溫度對黏度的影響；b-溫度、催化劑用量對黏度的影響；c-時間、催化劑用量用黏度的影響圖3 降解參數對黏度影響的等高線圖Fig.3 Contour plot showing the effect of variables (temperature, time, catalyst dosage) and their mutual effects on the viscosity of degradation products

表3 不同黏度降解產品的分子質量測定結果Table 3 Molecular weight determination results of degradation products with different viscosity

圖4 不同分子質量樣品的示差圖譜Fig.4 Refractive index of samples with different molecular weights

2.3 理化性質檢測

對未處理海藻酸鈉和不同降解程度樣品進行紅外光譜掃描，整體峰形、1 095、1 037 cm-1的C—O伸縮峰、3 440 cm-1的羥基吸收峰、1 619、1 420 cm-1的羧基峰等特征峰位置均無明顯改變，表明降解處理對海藻酸鈉糖鏈結構特征無影響(圖5)。表面掃描電鏡顯示，降解處理后海藻酸鈉顆粒仍保持原有顆粒形態，但表面形貌改變，粗糙程度加大，出現孔洞等腐蝕樣外觀，且隨降解程度加大而更加明顯(圖6)。

a-未處理海藻酸鈉，數均分子質量198.6 kDa;b-數均分子質量71.3 kDa的海藻酸鈉降解產物;c-數均分子質量38.3 kDa的 海藻酸鈉降解產物;d-數均分子質量15.4 kDa的海藻酸鈉降解產物圖5 海藻酸鈉及降解產物樣品的紅外光譜掃描結果Fig.5 FT-IR spectra of sodium alginate and degradation products

a-未處理海藻酸鈉，數均分子質量198.6 kDa;b-數均分子質量 112.4 kDa的海藻酸鈉降解產物;c-數均分子質量15.4 kDa的 海藻酸鈉降解產物;d-未處理海藻酸鈉，數均分子質量198.6 kDa; e-數均分子質量112.4 kDa的海藻酸鈉降解產物;f-數均分子質量 15.4 kDa的海藻酸鈉降解產物圖6 海藻酸鈉及其降解產物的掃描電鏡圖像Fig.6 The SEM photograph of sodium alginate and degradation products 注：a～c，標尺50μm；d～f，標尺2 μm

3 討論和結論

目前海藻酸鈉降解的主要研究方向是酶解法，微生物產生的降解酶多樣性較高，降解產物在糖鏈長度、單糖序列、末端組成上各有差異，酶解法降解程度高，可獲得從單糖至10糖的寡糖，且環境友好符合產業發展方向，在海藻酸鈉功能性寡糖的生產上極具前景[15-20]。研究報道中酶解均在水相中進行，海藻酸鈉溶液濃度均不超過1%(質量分數)，效率并不理想，且降解后水的去除需要大量能耗和成本，限制了工業化放大應用。因此開發多糖無法溶解的非均相降解方法可提高效率、降低成本、有利于工業化應用。本研究中，固相的多糖微粒在DES液體中分散而不溶解，可避免提高濃度導致黏度迅速增加的問題，在使用小型磁力攪拌器和轉子的情況下，體系中多糖與溶劑的比例可達到1∶3～1∶4(g∶mL)，多糖濃度可達20%～25%(質量分數)，在工業生產中使用攪拌效果更好的設備還可進一步提高多糖濃度，極大提高了生產效率；降解過程中多糖及其降解產物始終為固體粉末狀態，降解結束后可通過簡便的固液分離操作得到降解產物，能耗可顯著降低；該方法在多糖深加工領域有良好應用前景。本研究得到的海藻酸鈉降解產物因分子質量降低，其水溶液黏度也明顯下降，數均分子質量15.4 kDa降解產物的15%(質量分數)水溶液黏度約為630 mPa·s，可考慮與酶解法聯用以提高酶解法效率。

基于海藻酸鈉的水凝膠等新材料在藥物緩釋、再生醫學、仿生學等方向被廣泛研究[26-27]，但不同分子質量對材料性質影響的研究相對較少，可能與目前缺乏不同分子質量的海藻酸鈉商品有關。WILLIAMS等[28]研究了不同比例的高、低分子質量海藻酸鈉組合制備可注射水凝膠并觀察1-磷酸鞘氨醇的緩釋及血管再生效果，高分子質量海藻酸鈉比例與藥物釋放速度呈反比且導致更明顯的內皮細胞遷移和血管組織發育。使用不同分子質量和甘露糖醛酸/古洛糖醛酸比例的海藻酸鈉制作益生菌微膠囊，20 kDa～60 kDa的低分子質量和甘露糖醛酸/古洛糖醛酸為30∶70時可形成更致密的組織結構，滲透性更低，對益生菌細胞有更好的保護效果[29]。對120 kDa中分子質量和180 kDa高分子質量海藻酸鈉在不同凝膠中進行比較，認為中分子質量海藻酸鈉形成的氣凝膠具有更好穩定性[30]。在本研究中，基于降解條件、黏度和分子質量之間的模型聯立，可通過控制溫度、催化劑用量和時間獲得具有特定分子質量的降解產物，這種在較寬分子質量范圍(15 kDa～110 kDa)內相對精確控制海藻酸鈉分子質量的降解方法此前未見報道。具有更加寬泛分子質量的海藻酸鈉可使材料性能更加豐富，有利于深化海藻酸鈉在各領域的研究應用。

本研究所得降解產物的Mn最小值為15.4 kDa，理論上由約75～80個單糖單元構成，在降解程度上明顯低于酶解法報道。降解程度的差異在于水相中多糖溶解使糖鏈伸展以充分暴露切割位點，在非均相體系中多糖顆粒未溶解，糖鏈無法充分伸展以暴露切割位點。電鏡圖像表明，降解一般發生在顆粒表面并隨孔洞的形成繼續深入。降解前多糖粉末粒徑分布或對降解效果有較大影響，需進一步研究。