基于代謝組學分析兩種產地青花椒中非揮發性成分的差異

楊青青，王智榮，彭林，陳巧莉，聞樂嫣，郭澤航，闞建全*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(農業農村部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶，400715) 3(中匈食品科學合作研究中心，重慶，400715)

花椒具有獨特的香味和口感，在中國烹飪和食品加工業中被廣泛用于辛辣調味。青花椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb.et Zucc.)這一品種氣味清香，且麻味濃厚，相比于紅花椒更受消費者的喜愛[1]。青花椒中主要有揮發油、氨基酸、香豆素、酰胺類化合物等化學成分，具有較高的營養價值及功能價值[2]。花椒中化學成分的含量和組成很大程度上取決于花椒自身品種和產地環境[3-4]。青花椒主產于重慶江津和四川金陽兩地，這2種青花椒在市場上廣受歡迎。但由于兩地的地理、氣候條件有所不同，可能會導致青花椒中化學成分的組成及含量存在差異，進而影響其風味和功能價值。

目前，國內外大量的研究均關注于青花椒的揮發油成分及其香氣特征，對于不同產地青花椒中的揮發油成分的研究已較為成熟[5-6]。除此之外，青花椒中的類黃酮、酰胺類、氨基酸等非揮發性物質在其滋味、藥用價值上起著關鍵作用，同樣極具研究和開發價值。但目前對青花椒中非揮發性成分的研究通常存在多指標檢測操作繁雜、測定結果籠統而不能體現其具體成分、缺乏深度等缺點。近年來興起的代謝組學技術為解決這一問題提供了新思路，其中非靶向代謝組學可對一定生理狀態或特定條件下的樣本中所有代謝物進行綜合全面、無偏性的高覆蓋檢測，可尋找和鑒定出不同樣品的差異代謝物，從而實現代謝特征的比較[7]，為精確完整地分析不同產地的青花椒非揮發性成分提供了可行性。

因此，本研究采用基于超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜法(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-electrostatic field orbital trap high resolution mass spectrometry，UPLC-QE-Orbitrap-MS)的非靶向代謝組學技術對金陽和江津兩產地青花椒中非揮發性成分進行全面的鑒定，同時結合主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least square discriminant analysis，OPLS-DA)等多元統計分析方法對2種青花椒進行區分，并篩選得到化學標記物，以期為青花椒精深加工提供理論基礎，為今后青花椒的優良種質資源篩選、栽培管理等方面提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青花椒，分別采自重慶江津和四川金陽。甲醇、乙腈、醋酸銨、氨水(均為色譜級)，上海安譜實驗科技股份有限公司；L-2-氯苯丙氨酸(純度≥98%)，上海恒柏生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1290超高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Q Exactive Orbitrap高分辨質譜，美國賽默飛世爾科技；JXFSTPRP-24研磨儀，上海凈信科技有限公司；VORTEX-5渦旋儀，其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

2種青花椒各設置6個生物組重復。將青花椒用粉碎機粉碎后過40目篩，備用。

1.3.2 代謝物的提取

青花椒中代謝物的提取方法基于相關文獻方法[8]略做修改。稱取50 mg青花椒粉末加入至2 mL離心管中，加入1 000 μL提取液[V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=2∶2∶1]后渦旋30 s將其混勻；隨后于研磨儀中45 Hz處理4 min，在冰水浴中超聲5 min，重復上述研磨和超聲步驟3次；將得到的溶液靜置在-20 ℃中1 h。靜置后，4 ℃下13 000 r/min離心15 min，取上清液過0.22 μm濾膜，準備上機檢測。

質控(quality control，QC)樣本是通過將以上所有待測樣本等量混合而制得，在液質檢測的過程中，每6～10個檢測分析樣本中插入一個QC樣本，與分析樣本的采用相同的檢測方法。QC樣本用于分析樣本在相同的處理方法下的重復性，以監測分析過程的重復性。通過對不同QC樣本的基峰離子流圖(basic peak ion current diagram，BPC)進行重疊展示分析，可以判斷代謝物提取和檢測的重復性以及儀器的穩定性。對所有樣本和QC樣本進行PCA分析，通過觀察QC樣本間的離散度，可以得知儀器分析的穩定性和可靠性。

1.3.3 UPLC-QE-Orbitrap-MS檢測條件

UPLC-QE-Orbitrap-MS檢測參考相關文獻并做一定的修改[9]。使用Agilent 1290超高效液相色譜儀以及Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)液相色譜柱。正離子模式(positive ion mode，PIM)下流動相A相為0.1%(體積分數)甲酸水溶液，流動相B相為乙腈，采用梯度洗脫：0～1.0 min，1% B；1.0～8.0 min,1%～99% B；8.0～10.0 min，99% B；10.0～10.1 min，99%～1% B；10.1～12 min，1% B。；負離子模式(negative ion mode，NIM)下流動相A相為5 mmol/L醋酸銨水溶液(用氨水調節pH值至9.0)，流動相B相為乙腈；梯度洗脫條件同正離子模式；進樣體積為1 μL，流速為0.5 mL/min。

Thermo Q Exactive質譜儀在控制軟件(Xcalibur，版本：4.0.27，Thermo)控制下進行一級、二級質譜數據采集。MS參數條件為：電噴霧(electrospray Ionization，ESI)離子源；噴霧電壓為3 800 V(PIM)或-3 100 V(負離子模式)；毛細管溫度為320 ℃，鞘氣流速為45 Arb；輔助氣流速為15 Arb；質量掃描范圍為70～1 000m/z，一級分辨率為70 000，二級分辨率為17 500；分步碰撞能量的強度取值為3；分步碰撞能量依次為20、40和60 eV，掃描速率為7 Hz。

1.3.4 數據處理與統計分析

首先，使用ProteoWizard軟件將經質譜分析后的原始數據轉成mzML格式；然后使用ChromaTOF軟件對質譜數據進行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析[10]。采用Compound Discover(2.0版，Thermo)和OSI-SMMS(1.0版，大連化學數據解決方案信息技術公司)，與MassBank、HMDB、MoTo DB、METLIN及Mzcloud數據庫等進行物質鑒定，再將質控樣本中檢出率50%以下或RSD>30%的峰去除。使用SIMCA 14.1軟件進行PCA、OPLS-DA等多元統計分析。

2 結果與分析

2.1 兩種青花椒中非揮發性代謝物信息的多元統計分析

2.1.1 PCA分析

PIM和NIM下2種青花椒樣本的BPC圖如圖1所示。所有樣品的儀器分析信號強、各個色譜峰分離效果較好。此外，檢測中插入的QC樣本的BPC圖可以很好地重疊，說明儀器具有較好的穩定性，樣品處理以及檢測的重復性高，為后續青花椒代謝物分析結果的準確性提供可行性。

2種青花椒非揮發性代謝物的PCA圖如圖2所示。2種模式下，PC1和PC2均已包含樣品中大部分的代謝物信息，可用于后續分析。同時，2組青花椒樣品以及QC樣本組的平行樣本均各自聚集在一起，因此組間具有較好的重復性，數據可信度較高。此外，2種青花椒在圖中都有著明顯的分離趨勢，能夠從總體上反應出2組樣品之間的代謝物差異。

2.1.2 OPLS-DA分析

PCA分析對相關性較小的變量不敏感，而OPLS-DA是一種監督模型，能以最大程度地分離樣品更有利于尋找差異代謝物。如圖3所示，各組樣本的重復點相距較近，且分別聚成一類，表明數據重復性好；同時，2個樣品各居一側，區分效果非常明顯。此外，NIM模式下R2Y = 0.997，Q2Y = 0.912，PIM模式下R2Y = 0.994，Q2Y = 0.970，表示該模型的解釋度和預測度良好。為避免出現過擬合的情況，采用了置換檢驗法對OPLS-DA在無差異情況下的建模效果進行了考察(圖3)。2種模式下R2Y′和Q2′均小于原始模型的R2Y和Q2，則說明模型有意義，不存在過擬合現象，都符合樣本數據的真實情況，具有良好的預測能力。后續可根據計算得出的變量重要性投影(variable importance inproject，VIP)值分析篩選其差異代謝物，VIP>1表示該代謝物對OPLS-DA模型中樣品組的分離起了重要作用[11]，VIP值越大表示該物質在區分兩樣本中的作用越關鍵。

a-PIM下的江津青花椒樣本；b-PIM下的金陽青花椒樣本；c-PIM下的QC樣本； d-NIM下的江津青花椒樣本；e-NIM下的金陽青花椒樣本；f-NIM下的QC樣本圖1 兩種模式下江津青花椒、金陽青花椒和質控樣本的基峰離子流圖Fig.1 BPC chromatogram of Jiangjin Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc., Jinyang Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.and QC samples in two modes

a-正離子模式；b-負離子模式圖2 兩種離子模式下2組樣品及質控的PCA結果Fig.2 PCA results of two groups of samples and quality control in two modes 注：Ck-金陽青花椒；Test-江津青花椒(下同)

a-正離子模式模型得分圖；b-正離子模式模型驗證圖； c-負離子模式模型得分圖；d-負離子模式模型驗證圖圖3 兩種離子模式下兩組樣品的OPLS-DA模型得分圖與模型驗證圖Fig.3 Scatter diagram of OPLS-DA model score and model verification of two groups in two modes

2.2 兩種青花椒中非揮發性代謝物的差異分析

2.2.1 非揮發性差異代謝物的篩選與分析

設定2種青花椒中非揮發性差異代謝物的初步篩選條件為P<0.05，VIP>1，經篩選共得到74種主要的非揮發性差異代謝物(表1)。為簡單、直觀地表現出代謝物的變化情況，以及顯示2種青花椒之間的總體模式特征，對這74種差異代謝物繪制了聚類熱圖(圖4)。在所有非揮發性差異代謝物中，總體上氨基酸類物質在江津青花椒中呈上調表達，糖類、有機酸類以及類黃酮大多在金陽青花椒中呈上調表達。造成2種青花椒中化學成分差異的因素可能與生長環境息息相關，例如氣候、土壤條件、海拔高度等。

圖4 兩種青花椒中差異代謝物熱圖Fig.4 The heat map of differential metabolite in two Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.

花椒中氨基酸的組成和含量是營養質量的關鍵指標，同時在呈味上也起著重要作用。由表1可知，氨基酸類化合物在江津青花椒中總體呈上調表達。2個樣本中的氨基酸呈現差異可能與土質有關，江津青花椒多栽植于山坡地，山地的土質條件較好，營養豐富，更有利于青花椒中氨基酸的合成[12]。此外，重金屬元素同樣也能誘導植物體內氨基酸的大量積累[13]。江津土壤中的硒含量非常豐富，但這種土壤中往往也會伴隨著重金屬元素的存在[14]。多項研究表明，相較于我國土壤中重金屬含量的背景值，江津表層土壤中會含有更多的重金屬元素，尤其是Cd元素[15-16]，因此江津青花椒在生長過程中可能會面對更多的重金屬脅迫。在此情況下，植物體內會增強脯氨酸合成酶的活性，或者抑制脯氨酸的氧化來應對重金屬脅迫[17]，因而在江津青花椒中脯氨酸會更多地積累。同樣地，有研究表明在江津青花椒中呈上調表達的組氨酸也在植物抵御重金屬脅迫上起著重要作用[18]。綜上，2種青花椒中的氨基酸類成分呈現較大差異有可能與土質條件和重金屬脅迫有關。

除氨基酸外，糖類、有機酸類及多酚黃酮類均在金陽青花椒中呈上調表達，這可能與兩地的光照和濕度有著緊密聯系。首先，花椒中的糖類成分主要存在于花椒果皮中，具有一定的營養價值，不可忽視[19]。有研究表明植物中糖類含量的變化可能是由于環境脅迫引起的，例如糖含量會因水分脅迫而增加[20]，從而對滲透脅迫起到抵御作用。例如在干燥條件下，植物中的海藻糖會表現出極強的水合能力，可以取代生物分子表面的結合水，從而加強了蛋白質和生物膜的穩定性來抵御干旱脅迫[21]。同時，海藻糖中的羥基與蛋白質的極性基團和膜的磷酸基團之間還可形成氫鍵，以此來維持細胞膜在極端條件下的穩態[22]。此外，如蔗糖、葡萄糖這種常見的可溶性糖在應對水分脅迫時也起到了關鍵作用，其可以增大細胞的溶質濃度，改善細胞的吸水能力[23]。金陽干燥的氣候可能會使青花椒更易受到水分脅迫，從而導致會糖類成分的大量積累。

同樣地，有機酸是一種代謝活性溶質，在植物體內參與滲透壓的調節和陽離子的平衡，因此水分脅迫也會促進有機酸的合成[24]。除了植物中常見的蘋果酸、莽草酸外，脫落酸的積累也在抗旱性中起著關鍵作用，它可以通過減少植物的蒸騰作用、穩定生物膜以及改變植物體內代謝來達到抗旱的目的[25]。同時，有機酸作為一種光合作用的中間體[26]，金陽長時間的日照便會導致有機酸在青花椒中的高度積累。

此外，由表1可得青花椒中的多酚黃酮類物質豐富，且大部分是在金陽青花椒中呈上調表達。多酚黃酮類化合物屬于植物的次生代謝產物，大多數通常是由于植物應對生物和非生物脅迫而合成的。有研究表明水分脅迫會誘導植物體產生氧化脅迫，例如蘆丁、槲皮苷、橙皮素等黃酮類化合物都具有較強的抗氧化活性，因而大量積累后可增強植物的氧化應激，從而增加其抗旱性能[27-28]。同時，由于金陽紫外線強度高，在高光照強度下編碼多酚黃酮類化合物生物合成的結構基因的表達和某些重要酶的活性會增加，因此多酚黃酮類化合物的含量也會隨之增加[29]。

表1 兩種青花椒中的非揮發性差異代謝物Table 1 Differential metabolites in two Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.

花椒果實中含量較高的肌苷、鳥苷在金陽青花椒中也呈現上調表達，這些物質具有增強免疫、延緩衰老等重要的生理活性[30]。鳥苷和肌苷的合成受激酶或核苷磷酸轉移酶的催化，該途徑的激活和調節同樣也會受到水分脅迫的影響[31]。總的來說，江津雨量充沛，濕潤多陰，而金陽日照時間長，紫外強度高，空氣干燥，兩地的氣候原因可能導致了2種青花椒中糖類成分、有機酸、多酚類黃酮等成分呈現出較大的差異。

2.2.2 化學標記物的篩選

為尋找植物中的內源性化學標記物，經大量的研究目前已形成了系統的代謝組學策略，通過PCA和OPLS-DA來進行篩選和驗證[32]，已成功應用于對不同地理來源的苦艾草[33]、芹菜[34]、甘藍[35]等的差異研究。為進一步確定引起2種青花椒差異的關鍵物質，參考基于代謝組學方法區分2種地理來源的生姜的研究[36]，從2種青花椒的74種非揮發性差異代謝物中，根據VIP>2、2組間的倍數變化差異(fold change，FC)>3和P<0.001(獨立樣本T檢驗)的條件繼續篩選出了9種具有極顯著差異的化合物，作為區分江津青花椒和金陽青花椒的特征性化學標記物，分別是羥基-α-山椒素、蔗糖、海藻糖、棉籽糖、奎尼酸、莽草酸、2-異丙基蘋果酸、L-精氨酸、L-賴氨酸。為了更直觀地了解化學標記物，使用箱形圖比較來自2個產地的青花椒樣品中這9種物質的含量豐度差異(圖5)。特征性標記物的鑒定為今后開發快速、針對性和低成本的診斷性生物標記物分析方法奠定了理論基礎，可應用于青花椒的育種或質量評估分析。

圖5 兩種青花椒中9種化學標記物的相對含量豐度Fig.5 Relative peak intensities of.nine chemical markers in two Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.

3 結論

采用基于UPLC-QE-Orbitrap-MS的非靶向代謝組學技術對2種青花椒的非揮發性成分進行鑒定分析，無監督的PCA分析以及OPLS-DA模型分析實現了對2種產地青花椒的明顯區分，說明代謝組技術可作為一種區分金陽青花椒和江津青花椒的有效手段。

2種青花椒中存在74種差異代謝物，包括有生物堿類、有機酸類、糖類、多酚黃酮類、酰胺類、香豆素類、氨基酸類等成分。從總體上看，氨基酸類成分在江津青花椒中呈上調表達，而有機酸類、糖類、多酚黃酮類等在金陽青花椒中呈上調表達，同時提出了2種青花椒中非揮發性成分差異的可能發生機制。此外，經進一步篩選確認了2個產地青花椒中具有極顯著差異的物質，分別是羥基-α-山椒素、蔗糖、海藻糖、棉子糖、奎尼酸、莽草酸、2-異丙基蘋果酸、L-精氨酸、L-賴氨酸，可作為區分這2種青花椒的特征性化學標記物。

綜上，本研究通過代謝組學技術可以對青花椒中非揮發性成分進行全覆蓋、無偏性的分析，從而能成功地對2種產地的青花椒進行區分，為今后青花椒的精深加工以及育種提供了參考方向。