TRIP13通過激活Notch1通路促進肝癌細胞對索拉非尼耐藥的機制研究

陶冬英，任典寰，范任華，楊菊林，于紀棉

索拉非尼是美國食品藥品監督管理局批準的治療晚期肝癌的一線靶向藥物，能顯著提高患者的中位生存時間，但隨著治療時間的延長，許多患者表現出耐藥性[1]，目前耐藥機制還不是特別清楚。甲狀腺激素受體相互作用蛋白13（TRIP13）是AAA+ATP酶超家族中的一員，位于染色體5p15.33，其在有絲分裂過程中紡錘體組裝檢查點和DNA損傷修復中發揮著重要作用[2]。最近研究發現，TRIP13在肝癌中的表達上調，且過表達TRIP13可促進肝癌的發展進程[3-4]，但是TRIP13與肝癌細胞的索拉非尼耐藥的關系目前相關報道未見。本研究擬建立索拉非尼耐藥性HepG2細胞株，來探究TRIP13在肝癌細胞索拉非尼耐藥中的作用和機制。報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 人肝癌細胞株HepG2購自中科院上海生命科學院細胞所，MEM培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司，索拉非尼購自美國Sigma公司，TransScript Reverse Transcriptase和2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）為北京全式金生物技術有限公司產品，RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，TRIP13兔多克隆抗體（1∶1 000）購自美國Thermo Fisher公司；Notch1兔單克隆抗體和Hes1兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling technology公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，TRIzol試劑和Lipofectamine 2000試劑盒購自美國Invitrogen公司，MTT試劑盒和Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，TRIP13 siRNA序列和對照序列由上海吉瑪公司合成：si-TRIP13序列，5’-GCTGGTAACCAAGATGTTT-3’；si-NC序列，5’-GCTCAATGAACGTAGGTTT-3’。

1.2 索拉非尼耐藥性HepG2細胞株的建立 采用濃度遞增法對HepG2肝癌細胞進行長時間的培養，建立索拉非尼耐藥HepG2細胞株（HepG2-SR）模型。選取HepG2為親本細胞，使用MEM培養基在37℃、5%CO2條件下培養，待細胞狀態穩定后，在培養液中加入1M索拉非尼，培養1周后，換成更高濃度的索拉非尼（每次增加1M），直至細胞能在10M索拉非尼培養液中穩定生長，表明HepG2-SR細胞成功誘導。

1.3 細胞分組和轉染 將2×106個HepG2-SR細胞接種到6孔板中，過夜貼壁后，細胞融合度達到60%左右，將細胞分成3組：對照組、si-NC組及si-TRIP13組。后兩組細胞按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書操作分別將50 nMsi-NC和50 nMsi-TRIP13轉染至細胞中，轉染6 h后更換培養基。對照組細胞不進行任何處理，37℃、5%CO2條件下繼續培養。

1.4 MTT檢測 細胞活力使用MTT檢測。分別將HepG2和HepG2-SR細胞按照3×103個/孔的密度接種至96孔板里，每孔加入1、5、10或者20M索拉非尼。細胞培養箱中培養48 h后，每孔加入10l MTT溶液，37℃繼續孵育4 h，加入100l異丙醇溶解沉淀，最后使用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值。使用Graphpad Prism 5軟件計算索拉菲尼的IC50（即抑制率50%時索拉菲尼的濃度）。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 將2×106個HepG2-SR細胞接種到6孔板中，按照上述方式轉染50 nM si-TRIP13和50 nM si-NC，轉染48 h后，加入10M索拉非尼培養24 h。用適量胰酶消化細胞，1 000 g離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數。取1×106個重懸細胞，1000 g離心5min，去除上清后加入195l Annexin V-FIT C結合液、5l Annexin V-FITC和10l碘化丙啶（PI），室溫避光孵育15 min后使用流式細胞儀進行檢測。

1.6 Real-time PCR檢測 細胞中TRIP13、E-cadherin和Vimentin mRNA水平使用real-time PCR方法檢測。利用TRIzol試劑提取各處理組中細胞的總RNA。使用oligo（dT）引物將2g總RNA逆轉錄成cDNA，按照PCR試劑盒說明書操作加入模板和引物，配置25l的反應體系，按照下面條件進行PCR反應94℃5 min；94℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，共35個循環；72℃5 min。TRIP13上游引物：5’-GCTTCCCCATCTGGTGCTTT-3’，下游引物：5’-GTGGCTTTCTAGCTTGCAGTC-3’；E-cadherin上游引物：5’-AGGGGTTAAGCACAACAGCA-3’，下游引物：5’-GGTGTATACAGCCTCCCACG-3’；Vimentin上游引物：5’-TCCGCACATTCGAGCAAAGA-3’，下游引物：5’-TGATTCAAGTCTCAGCGGGC-3’；-actin上游引物：5’-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3’，下游引物：5’-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’。使用-actin作為內參，按照公式2－Ct計算TRIP13、Ecadherin和Vimentin mRNA的表達量。

1.7 Western blot檢測 將適量RIPA裂解液加入細胞中，充分裂解后，12 000 g離心15 min。蛋白濃度使用BCA法進行測定。每個樣品取40g蛋白，沸水浴變性后上樣進行SDS-PAGE電泳。將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上后，用溶解于TBST緩沖液中的5%脫脂奶粉封閉2 h。然后加一抗4°C過夜孵育，接下來使用TBST緩沖液清洗3次后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，再加入ECL發光液顯色。以-actin為內參，計算TRIP13、Notch1和Hes-1蛋白的相對表達量。

1.8 統計方法 數據采用SPSS20.0軟件分析，所有實驗最少重復3次，計量數據用均數±標準差表示，多組間比較采用F檢驗，多重比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TRIP13表達及MTT結果 采用濃度遞增法對HepG2肝癌細胞進行長時間培養，建立HepG2-SR細胞模型。MTT檢測顯示索拉非尼對HepG2和HepG2-SR細胞的IC50分別為4.72M和26.42M（圖1A）。HepG2-SR細胞的IC50比HepG2細胞增加了5.6倍，這說明HepG2-SR細胞成功建立。Realtime PCR和westernblot檢測TRIP13 mRNA和蛋白水平表達，結果如圖1B和1C所示：與HepG2細胞相比，HepG2-SR細胞中TRIP13 mRNA和蛋白水平均顯著增加（P＜0.05）。

圖1 HepG2-SR細胞中TRIP13表達上調

2.2 HepG2-SR細胞對索拉非尼的敏感性 檢測不同處理的HepG2-SR細胞中TRIP13表達，結果顯示：與si-NC組相比，si-TRIP13組中TRIP13的表達顯著降低（P＜0.05，圖2A）。MTT檢測各組細胞中的IC50，結果顯示：si-NC組和si-TRIP13組中IC50分別為27.30M和8.94M。與si-NC組相比，si-TRIP13組中IC50顯著降低（P＜0.05，圖2B）。流式細胞術檢測細胞凋亡，結果見圖2C：與si-NC組相比，si-TRIP13組中凋亡細胞數目明顯增多（P＜0.05）。

圖2 下調TRIP13可增加HepG2-SR細胞對索拉非尼的敏感性

2.3 HepG2-SR細胞的上皮間質轉化 結果如圖3所示：與si-NC組相比，si-TRIP13組中E-cadherin mRNA表達顯著增加，Vimentin mRNA水平顯著降低（P＜0.05）。

圖3 下調TRIP13可抑制HepG2-SR細胞的EMT

2.4 生物信息學預測肝癌組織中TRIP13與Notch1的關系 使用Starbase軟件分析TRIP13與Notch1基因在374例肝癌組織中的相關性，發現TRIP13表達與Notch1水平在肝癌組織中呈現正相關（r=0.33，P＜0.01）。見圖4。

圖4 TRIP13與Notch1表達在肝癌組織中的相關性分析

2.5 下調TRIP13可抑制Notch1通路活化 Western blot檢測HepG2-SR細胞中Notch1和Hes-1表達，結果如圖5所示，與si-NC組相比，si-TRIP13組中Notch1和Hes-1降低（P＜0.05）。

圖5 HepG2-SR細胞中下調TRIP13可抑制Notch1通路活化

3 討論

AAA+ATP酶家族包含53個成員，這個家族的蛋白通過水解ATP產生機械能改變蛋白質和多核苷酸的構象，在蛋白質降解、DNA復制和膜融合事件中發揮作用[5]。越來越多的研究發現，AAA+ATP酶家族蛋白參與了多種腫瘤的發生和進展過程[6]。TRIP13是AAA+ATP酶家族中比較保守的一個成員，在多種腫瘤中其表達明顯上調，且表達量與患者的不良預后相關。最近的文獻報道顯示，TRIP13在肝癌組織中表達升高，高水平的TRIP13與患者較差的預后有關。過表達TRIP13可促進肝癌生長和轉移[3]，但是目前國內外還沒有文獻報道TRIP13與肝癌索拉非尼耐藥的關系。

本研究發現，HepG2索拉非尼耐藥性細胞株HepG2-SR中TRIP13表達較HepG2親本細胞高，這表明TRIP13可能參與了肝癌細胞的索拉非尼耐藥。使用siRNA技術在HepG2-SR細胞中下調TRIP13，發現下調TRIP13后，索拉非尼對細胞的IC50值降低，細胞凋亡增加。這表明下調TRIP13可增加肝癌細胞對索拉非尼的敏感性。

研究已經證實EMT不僅在肝癌進程中促進惡性肝癌細胞的擴散，也在包含索拉非尼在內的多種藥物耐藥中發揮著重要作用，抑制EMT可逆轉癌細胞對藥物的耐藥[7-8]。在多種癌癥中都發現TRIP13可以調節EMT進程[3,9]。本研究結果發現，下調TRIP13可抑制HepG2-SR細胞的EMT。這表明TRIP13增加肝癌細胞索拉非尼耐藥與其促進EMT有關。Wang等[10]的研究發現Notch1信號在索拉非尼耐藥的肝癌細胞中被激活，而且Notch1信號活化能夠促進肝癌細胞對索拉非尼耐藥。Notch1是調控癌細胞發生EMT的一個重要信號通路[11]。本課題組通過生物信息學的方法分析發現，在肝癌組織中TRIP13與Notch1的表達呈現正相關。這說明在肝癌的索拉非尼耐藥中TRIP13可能與Notch1存在著某種聯系。Hes-1是Notch1下游一個重要的調控分子，本研究結果顯示，下調TRIP13顯著降低了Notch1和Hes-1的表達，這表明下調TRIP13可抑制Notch1通路的活化。

綜上所述，TRIP13在索拉非尼耐藥的肝癌細胞中表達升高，它可增加肝癌細胞對索拉非尼耐藥，這可能是通過激活Notch1通路，進而促進肝癌細胞的EMT引起的。TRIP13的水平可能是預測肝癌細胞對索拉非尼反應的一個潛在標志物，聯合TRIP13拮抗劑和索拉非尼治療可能能夠增強索拉非尼抗肝癌的治療效果。