調節性T細胞缺陷程度對毒性彌漫性甲狀腺腫療效及預后的影響

李莉華 鄭凝

(天津市北辰醫院，天津 300400)

毒性彌漫性甲狀腺腫(GD)是一種自身抗體介導的自身免疫性疾病，可導致甲狀腺激素過度產生并因此引起全身代謝級聯功能異常。女性GD發病率更高，每年的發病率約為14/10萬〔1，2〕，發病率呈逐年上升趨勢。目前GD的發病機制仍不明確。有學者提出T淋巴細胞，主要為CD4+T細胞和CD8+T細胞在疾病發生發展起作用，也有研究發現Th17/調節性T細胞(Treg)體內平衡在多種自身免疫性疾病中被破壞〔3〕。Treg細胞是一類控制體內自身免疫反應性的T細胞亞群，有研究報道Treg細胞及相關細胞因子與多種免疫性疾病的發生關系密切，其異常表達可導致自身免疫性疾病〔4，5〕。GD目前常見的治療方式包括抗甲狀腺藥物、放射性碘(RAI)治療、手術治療等。131I治療其療效好，經濟實惠，在中國有超過半數的醫師選擇131I治療，因此如何提高131I治療有效率在中國臨床實踐中意義重大，本研究探討調節性T細胞缺陷程度對GD療效及預后的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016～2018年于天津市北辰醫院門診行131I治療的GD患者40例，男19例，女21例，年齡61～75歲，患者一般資料差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。分別在第3、6、12個月進行治療隨訪，收集患者基本信息及臨床數據，停藥后所有入組患者進行18個月隨訪記錄患者復發情況，本研究獲得醫院倫理委員會批準，患者均簽署了知情同意書。

1.2納入及排除標準 符合GD診斷標準〔6〕：①臨床甲亢癥狀和體征。②甲狀腺彌漫性腫大(觸診和B超證實)，少數病例可以無甲狀腺腫大。③血清促甲狀腺激素(TSH)濃度降低，甲狀腺激素濃度升高。④眼球突出和其他浸潤性眼征。⑤脛前黏液性水腫。⑥甲狀腺TSH受體抗體(TRAb或TSAb)陽性。以上標準中，①②③項為診斷必備條件，④⑤⑥項為診斷輔助條件；排除標準：①腫瘤；②炎癥性疾?。虎坶L期使用糖皮質激素或免疫抑制劑者。

1.3方法

1.3.1治療方法 所有入組患者選擇針對性治療方案，由專業醫師先通過B超測量甲狀腺各徑線，對體積進行估算，甲狀腺質量(g)的計算公式：0.479×甲狀腺體積〔V(cm3)=a×b×c，a、b、c分別代表長寬厚，雙葉甲狀腺之和為體積〕。依據患者的甲狀腺吸碘率及甲狀腺質量計算劑量，131I治療劑量(Bq或mCi)=計劃量(Bq或mCi/g甲狀腺組織)×甲狀腺質量(g)×100/甲狀腺最高(或24 h)攝131I率(%)，同時在治療過程中隨時根據患者年齡、甲狀腺大小、軟硬度、是否有結節等因素調整劑量，治療方式除特殊情況一般為單次空腹口服，本研究的131I治療劑量均值為在(2.71±2.53)mCi。

1.3.2療效評價 本研究中治療結局符合中國131I治療格雷夫斯甲亢指南(2013版)〔7,8〕，131I治療GD療效的標準〔9〕。①完全緩解：恢復正常，無甲亢癥狀和血清游離三碘甲腺原氨酸(FT3)，血清游離甲狀腺素(FT4)正常；②部分緩解：甲亢癥狀和體征減輕，FT3、FT4明顯降低，未降至正常；③無效：患者癥狀和體征無改善或加重，FT3、FT4無明顯降低；④復發：131I治療后完全緩解，再次出現甲亢癥狀及體征，血清甲狀腺素水平再次升高；⑤甲狀腺功能減退癥(甲減)：甲減的癥狀和體征，甲狀腺激素水平低于正常。治療有效為完全緩解和部分緩解之和。

1.3.3外周血FT3、FT4、TSH、TRAb檢測 空腹抽取靜脈血后離心，吸取血清后用放射免疫法測定(醫學檢驗科采用美國Diasorin公司檢測盒檢測)。判定標準：FT3正常值范圍：3.18～9.22 pmol/L；FT4正常值范圍：8.56～25.60 pmo/L；TSH正常值范圍：0.3～5.0 IU/ml；TRAb正常值范圍<9 U/L，陽性>14 U/L，兩者之間為可疑需要進行定期復查。

1.3.4外周血淋巴細胞亞群分析 流式細胞儀抗體和試劑均購自美國加利福尼亞州圣地亞哥的BioLegend。Ficoll-Paque密度梯度離心分離獲得單核細胞，調整細胞數約為1×106/ml，用僵尸紅可固定活細胞試劑盒(BioLegend77475)清除死細胞后，用APCCY7-CD49b(103116)、PEC5.5-CD4(100434)、PECY7-CD8(100722)、染色20 min，固定通透性(421402)后用FITC-GZMB(372206)，Treg細胞需要FOXP3破膜，抗體染色細胞內GZMB用facs-dxp-athenatm(Cytek，美國)分析染色細胞，其中PEC5.5-CD4水平代表CD4+T細胞水平，PECY7-CD8水平代表CD8+T細胞水平，APCCY7-CD49b-FOXP3水平代表Treg細胞水平。數據用Flow Jo10.0軟件進行進一步分析。

1.3.5酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定轉化生長因子(TGF)-β，白細胞介素(IL)-10濃度 檢測ELISA試劑盒均購自美國賽默飛公司，使用方法是標準品的稀釋與加樣，隨后加樣：分別設空白孔(不加樣品)及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。然后溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。最后洗滌加酶后運用酶標儀測定吸光度制成標準曲線，從而計算樣品中細胞因子TGF-β，IL-10的濃度。

1.4統計學方法 使用SPSS22.0軟件行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1GD患者治療前后甲狀腺功能比較 治療后，GD患者FT3、FT4水平及TRAb陽性率均明顯低于治療前，且隨著治療時間不斷下降；TSH水平明顯高于治療前，且隨著治療時間不斷升高，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 GD患者治療前后甲狀腺功能比較

2.2131I治療療效隨訪 治療3個月隨訪，治療有效31例(77.50%)；治療6個月隨訪，治療有效33例(82.50%)；治療12個月隨訪，治療有效37例(92.50%)，隨著131I治療時間的延長，治療有效率也隨之增加，差異均有統計學意義(均P<0.05)。

2.3治療前后淋巴細胞亞群及細胞因子水平比較 經131I治療后，淋巴細胞亞群CD4+和CD8+上升，CD4+/CD8+的比例也呈上升趨勢，慢慢接近正常比值，Treg細胞的水平也隨著治療逐漸升高，治療3個月、6個月、12個月后的檢測與治療前比較明顯升高(P<0.05)，細胞因子檢測發現TGF-β隨著治療時間延長而上升，而IL-10降低，在治療3個月、6個月、12個月后的檢測與治療前相比差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 GD治療前后淋巴細胞亞群及細胞因子水平比較

2.4治療后隨訪復發情況 治療后經過隨訪18個月，復發率為5%，相較于未復發患者，復發患者群體Treg細胞呈低水平狀態，IL-10水平更高，TGF-β水平更低(P<0.05)。見表3。

表3 治療后隨訪復發與未復發患者Treg細胞及細胞因子水平比較

3 討 論

GD疾病的發病機制可能與免疫功能T淋巴細胞的失衡有關，當CD4+T細胞受到某些炎性因子的刺激后，從而分化為Th0細胞，此后可進一步分化為Th1和Th2，分別介導細胞免疫和體液免疫。CD8+T細胞代表著T抑制/細胞毒性細胞亞群，CD4+T/CD8+T細胞比例可以作為疾病一個重要觀測指標〔10〕，國外學者報道通過采用流式細胞技術發現淋巴細胞亞群參與了甲狀腺免疫性疾病的發生及發展〔10〕，其他研究也報道了甲狀腺疾病中存在淋巴細胞特別是Treg細胞免疫調節作用減弱〔11〕。Treg細胞是調節型淋巴細胞，主要通過釋放IL-10等在疾病免疫中發揮調節作用〔12〕，已有研究報道Treg在不同免疫介導和感染性疾病的發病機制起作用如糖尿病、食物過敏、多發性硬化、惡性疾病等，在Treg發揮免疫調節作用相關細胞因子IL-10，TGF-β也認為與其功能發揮密切相關〔13〕。GD患者的特征是產生自身抗體TRAb。隨著長期治療，血清TRAb濃度下降，但在一些患者，盡管臨床穩定，TRAb持續多年是否構成一個可通過循環淋巴細胞表型分析識別的患者淋巴細胞亞群，一直待探索〔14，15〕，IL-10及TGF-β的水平高低及活躍程度一直被認為與GD疾病活動度正相關〔16，17〕。

131I治療療效可能是通過治療產生的射線從而破壞組織，壞死的組織同時會造成相關的抗原耗竭，與此同時組織中活化的T細胞與相關細胞因子也受到清除〔18〕；療效的改善可能與系統免疫功能受到抑制被迅速糾正，從而免疫系統的穩態能夠重新建立，Treg細胞抑制狀態改善后將重新恢復其維持免疫系統〔19〕。但與甲狀腺功能恢復完全正常相比，免疫系統重新達到平衡過程較慢，所需時間較長，在停止治療后仍有5%患者復發，本研究通過流式檢測觀察到復發的患者Treg細胞水平仍受到抑制，ELISA示相關細胞因子復發患者仍偏離正常。