草果知母湯介導mTOR信號通路對腦卒中大鼠神經元自噬與凋亡的影響

張高煉 郭建輝 曾敬 李敏 陳銳 張曉寧 劉姍姍 梁韡斌

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院仙葫院區顱腦外科，廣西 南寧 530023)

腦卒中是嚴重危害我國中老年人群身體健康的重要疾病〔1〕。目前針對腦卒中的有效治療是治療時間窗內實施溶栓治療，快速恢復供血〔2〕。但現階段，我國的醫療配置尚不完善，城市偏遠地區患者往往難以獲得快速溶栓治療，長時間缺血后再溶栓可能會導致神經元不可逆損傷〔3,4〕。細胞自噬是由自噬小泡包裹胞內受損細胞器及錯誤折疊蛋白，轉運至溶酶體降解的過程〔5〕。細胞自噬旨于維持細胞內營養，保證內環境穩定，是機體對抗外界刺激自我激活的一種自我保護過程，但自噬的過度激活會導致細胞程序性死亡。腦缺血初期〔6〕，血氧不足時，細胞自噬激活，快速清除受損神經元以維持營養，促進細胞存活。但隨著病情發展，一些完整結構細胞被過度消化和降解，觸發非凋亡程序性細胞死亡，降低神經元細胞的存活率〔7〕。草果知母湯記載于《瘟病條辯》，經臨床與動物研究顯示具有顯著的神經保護作用，對于神經退行性疾病癲癇造成的認知功能損傷具有明顯改善作用〔8〕，但對缺血性腦卒中的治療效果尚不清楚，因此本實驗就草果知母湯對腦缺血再灌注后神經功能與認知功能的影響進行研究，為臨床使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 8周齡SD大鼠，雄性，體重220～240 g，50只，由廣西醫科大學醫學動物中心提供。動物飼養條件：溫度22～24℃，濕度60%～65%，自由飲食攝水。所有動物適應環境1 w，進行腦缺血再灌注造模，次日，大鼠清醒后根據神經功能評分進行隨機分組，分為：假手術組(Sham組)、腦缺血再灌注組(I/R組)、草果知母湯組(Decoction組)和草果知母湯+雷帕霉素組(Decoction+Rap組)。其中Decoction組參考臨床使用劑量，將人與大鼠體表面積換算獲得劑量為5 g/kg，灌胃給藥，雷帕霉素劑量為20 mg/kg，腹腔注射。Sham組與I/R組灌胃等體積生理鹽水，每天連續給藥或者生理鹽水7 d。

1.2實驗試劑和器材 中藥草果知母湯主要成分為草果、知母、厚樸、半夏、黃芩、甘草。所有中藥各取50 g混合，沸水回流提取2次，第1次10倍體積水回流提取2 h，第2次8倍體積水回流提取1.5 h。藥液過濾后合并濃縮至300 ml，即所有生藥濃度為1 g/ml，4℃保存。

雷帕霉素(上海麥克林公司)，戊巴比妥鈉(阿拉丁生物公司)，圓頭尼龍線栓(廣州佳靈生物技術公司)，2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC，美國Sigma公司)，Nissl染色試劑盒(北京百奧萊博科技公司)，TUNEL染色試劑盒(美國Abcam公司)，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體、自噬效應蛋白(Beclini)抗體，微管相關蛋白(LC3)抗體(美國Cell Signaling Technology公司)，β-肌動蛋白(actin)抗體(上海碧云天公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(武漢三鷹生物公司)。二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Thermo公司)。

1.3腦缺血再灌注造模 所有大鼠使用戊巴比妥鈉完全麻醉(40 mg/kg)。仰臥位固定于手術板上，頸部消毒備皮，頸部正中左側3 mm處切口暴露頸動脈，鈍性分離出頸總動脈與頸外動脈，結扎頸外動脈遠心端，暫時封閉頸總動脈與頸外動脈。頸外動脈開口，插入圓頭線栓，沿分叉進入頸內動脈，以線栓圓頭前進15 mm為腦缺血造模終點，此時，線栓完全阻斷頸總動脈入腦血流。3 h后，拔出圓頭線栓，恢復腦區供血。其中Sham組麻醉后，僅分離出頸動脈。次日，對各組大鼠進行神經功能評分，除Sham組，剔除0分與4分的動物，保證30只動物手術后存活。

1.4神經功能評分 以Longa標準進行評分。0分：動物正常運動，四肢正常；1分：動物正常行走，但提起動物后，前肢蜷縮無法伸展；2分：動物正常行走但無法直線前行，向一側旋轉，前肢蜷縮無法伸展；3分：動物運動行為減少，向一側行走且轉小圈；4分：動物無法行走，完全癱瘓。

1.5水迷宮測試 所有動物給藥7 d后，進行水迷宮測試，期間持續給藥。水迷宮裝置為一個直徑1.8 m的圓形恒溫水池，分為四個象限。隨機選一象限中央設置直徑12 cm的水下平臺。整個實驗共5次，訓練4次，測試1次。訓練期間，自池壁將大鼠放入水中，記錄大鼠90 s內探索并登上平臺的路徑與時間，記為潛伏期。若大鼠90 s內未找到平臺，則記為90 s，引導大鼠至平臺，并滯留5 s。測試期間，撤去平臺，記錄大鼠首次到達平臺時間與穿越平臺次數。

1.6TTC染色 水迷宮測試結束后，深度麻醉大鼠，迅速斷頭，取出大腦置于-20℃冰箱中20 min。大腦硬度適于切片時取出，沿冠狀位將腦組織切成5片并浸入TTC溶液中，37℃水浴避光孵育30 min，結束后吸出TTC溶液，使用相機拍攝照片，測量腦梗死面積。

1.7透射電子顯微鏡組織片制備 取大鼠缺血側皮層約1 mm×1 mm×1 mm組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，組織在2.5%戊二醛溶液中固定2 h，PBS洗去表面戊二醛后在1%四氧化鋨中后固定處理。使用梯度乙醇與丙酮脫水后進行包埋，應用超薄切片儀切片(片厚50 nm)，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡下觀察神經細胞結構，并拍照記錄。

1.8免疫組化石蠟切片制備 水迷宮測試結束后，深度麻醉大鼠。打開胸腔，經心尖處插入灌注針，泵注PBS溶液，自心耳流出血液，以流出液體澄清無血色結束。再以50 ml 4%多聚甲醛灌注，完整的取出大腦，儲存于4%多聚甲醛溶液中。4℃儲存24 h后，使用梯度乙醇進行脫水，結束后，取出腦組織置于乙醇和二甲苯混合溶液中透化，最后石蠟包埋，使用切片機切成5 μm切片并進行下一步操作。

1.9蘇木素-伊紅(HE)染色 取石蠟切片脫蠟至水，使用蘇木素溶液中常溫下反應5 min，PBS終止反應并清洗切片，再以1%鹽酸酒精分化后的伊紅溶液反應30 s，最后進行常規的脫水和透化，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察并拍片。

1.10TUNEL染色 取石蠟切片脫蠟至水，高溫、高壓條件下抗原修復15 min，以4%牛血清白蛋白(BSA)溶液封閉2 h。將切片浸入50 μl的TUNEL反應溶液中，37℃條件下避光反應60 min。隨后將50 μl鏈霉親和素耦聯辣根過氧化物酶(streptavidin-HRP)工作液加入，避光孵育30 min，加入50 μl二氨基聯苯胺鹽酸鹽(DAB)底物溶液顯色，清洗后用蘇木素于室溫下進行復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透化，中性樹脂封片，在光學顯微鏡下觀察并拍片。

1.11Western印跡 取缺血側皮層、海馬組織，加入裂解液，冰上勻漿后混懸并再裂解30 min，12 000 r/min離心10 min并收集上清液，使用BCA試劑盒進行蛋白定量，沸水使蛋白變性。等量上樣且十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)結束后，對膠上蛋白進行轉膜，轉膜后以4%BSA溶液封閉2 h。洗凈封閉液后加入一抗并孵育過夜。次日，清洗PVDF膜，加入HRP標記二抗。室溫孵育2 h后，使用電化學發光(ECL)液和凝膠成像系統進行顯色，結果使用Image J進行分析

1.12統計學方法 采用SPSS20.00軟件進行雙因素方差檢驗、單因素方差檢驗、Tukey檢驗。

2 結 果

2.1草果知母湯對腦卒中大鼠學習記憶能力的影響 腦缺血造模至給藥治療結束，Sham組10只大鼠全部存活，I/R組死亡2只，Decoction與Decoction+Rap組給藥過程中各死亡1只。水迷宮訓練與測試結果見表1。隨著訓練次數的增加，各組大鼠尋找平臺的潛伏期均減少，訓練第2次開始，與Sham組相比，I/R組與Decoction+Rap組尋找平臺潛伏期顯著增加(P<0.05)；與I/R組相比，水迷宮訓練第3次開始，Decoction組大鼠平臺尋找潛伏期顯著減少(P<0.05)。水迷宮測試中，與Sham組相比，I/R組大鼠尋找平臺時間顯著增加(P<0.05)，且穿越平臺次數顯著減少(P<0.05)，而草果知母湯給藥顯著減少了大鼠尋找平臺時間(P<0.05)，增加了大鼠穿越平臺次數(P<0.05)。

表1 各組大鼠尋找平臺的潛伏期與穿越平臺次數比較

2.2草果知母湯對腦卒中大鼠神經功能與缺血側梗死的影響 如表2所示，I/R組大鼠神經功能出現損傷，多數大鼠表現為行為呆滯，爬行易跌倒；與I/R組相比，草果知母湯治療顯著降低了大鼠神經功能評分(P<0.05)，多數大鼠表現為可直線前行；雷帕霉素與草果知母湯共同干預卻增加了神經功能評分。如表2和圖1所示，Sham組沒有出現任何的神經功能損傷，而I/R組大鼠腦中出現大面積梗死；與I/R組相比，Decoction組大鼠腦組織中白色梗死面積顯著減少(P<0.05)，但雷帕霉素的干預則增加了腦缺血中白色的梗死區域。

圖1 各組腦組織梗死區域染色

表2 大鼠腦組織梗死區域比例量化統計與神經功能評分

2.3草果知母湯對腦卒中大鼠神經元狀態的影響 如圖2所示，HE染色顯示Sham組中神經元排列整齊，細胞分布層次清晰，細胞質染色較淺且細胞膜

完整，細胞飽滿呈橢圓分布。與Sham組相比，I/R組中，神經元分布雜亂無章，細胞質染色較深且細胞膜破裂，細胞之間界限模糊且嚴重萎縮。草果知母湯的干預則顯著改善了腦中神經元狀態，而雷帕霉素的干預則造成大鼠腦中細胞損傷較多。

2.4草果知母湯對腦卒中大鼠神經元凋亡的影響 如表3、圖3所示，TUNEL染色顯示與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織中陽性細胞數顯著增加(P<0.05)，而草果知母湯的治療則顯著減少了腦組織中陽性細胞數(P<0.05)，但雷帕霉素的干預則造成腦組織中陽性細胞數再次出現增加。

圖3 各組腦組織區域神經元TUNEL染色(×100)

表3 大鼠腦組織中神經元TUNEL染色陽性細胞比例

2.5草果知母湯對腦卒中大鼠神經元自噬的影響 如圖4所示，透射電子顯微鏡顯示，Sham組神經元結構較為完整，自噬小體與溶酶體形成較少；但I/R組神經元結構缺損，部分區域呈單層膜結構，形態出現萎縮且部分細胞器出現腫脹，視野中有大量的自噬小體形成；與I/R組相比，草果知母湯治療顯著改善了細胞的形態，減少了自噬小體的形成；但雷帕霉素的干預卻造成自噬小體增加，導致細胞中部分細胞器出現腫脹。

紅色箭頭：自噬小體圖4 各組腦組織區域神經元自噬

2.6草果知母湯對腦卒中大鼠神經元自噬相關蛋白的影響 如表4、圖5及圖6所示，與Sham組相比，I/R組腦組織中mTOR蛋白水平表達顯著增加，而與I/R組相比，草果知母湯顯著增加了腦組織中mTOR蛋白水平(P<0.05)；雷帕霉素作為mTOR抑制劑，減少了腦組織中mTOR表達。與Sham組相比，腦缺血再灌注增加了Beclin1表達(P<0.05)，促進了LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化；與I/R組相比，草果知母湯顯著減少了腦組織中Beclin1與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(P<0.05)。

圖6 前額皮層組織中mTOR、Beclin1與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達

表4 大鼠腦組織中mTOR、Beclin1與LC3-II/LC3-I表達

1～4：Sham組，I/R組，Decoction組，Decoction+Rap組；圖6同圖5 海馬組織中mTOR、Beclin1與LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達

3 討 論

腦卒中在中醫理論上屬于“中風病”范疇，以猝然昏撲，不省人事，半身不遂，言語不利為病征〔9〕。其病機為陰陽失調，氣血逆亂〔10〕。病因為多為飲食不節、情志失調、正氣不足及勞倦過度等。《靈柩·刺節真邪》提出〔11〕：“虛邪偏克于身半，其入深，內居營衛，營衛稍衰，則真氣去，邪氣獨留，發為偏枯”，提示營衛衰弱，真氣散失，邪氣獨留是發病病機。唐宋以后，易水學派李東垣表示：“凡人年逾四旬，氣衰之際，因憂喜憤怒傷其氣者，多有此疾”，即正氣不足是腦卒中的關鍵因素〔12〕。對此中醫提出滋陰潛陽、涼血散瘀作為腦卒中治療策略。草果知母湯方中草果溫太陰獨勝之寒，知母泄陽獨盛之熱〔13〕，兩者共為君藥；厚樸、半夏行胃氣、化痰濁，佐草果泄中焦之溫蘊，同為臣藥；甘草健脾補中，調和諸藥。全方從脾胃入手，苦辛、寒熱平調，以恢復脾胃正氣轉樞為要旨，上行正氣，清濁化濕，驅熱散邪，以達治病功效。

與中醫理論上“中風病”所定義的“半身不遂，言語不利”表現一致的是腦缺血再灌注后機體出現神經功能損傷與記憶功能衰退，這些癥狀是臨床溶栓后機體恢復的主要障礙，其作用機制與持續的自由基損傷，炎癥反應增加，神經元過度自噬等多種因素相關〔14,15〕。本研究提示草果知母湯能夠有效改善腦缺血再灌注介導的損傷，其機制可能與抑制神經元過度自噬相關。

細胞自噬是一種高度保守的，旨在通過溶酶體途徑對損傷的細胞器及錯誤蛋白進行分解，以保證細胞自身的內環境穩定的自我保護機制〔16〕。細胞此時能夠有效抵御外界刺激，延緩凋亡過程，但過度的細胞自噬則會吞噬一些完整的功能性細胞，造成神經元損傷。其中過度自噬的特點是自噬小體增加，線粒體腫脹變形、細胞空泡化明顯，部分細胞器腫脹碎裂〔17〕。生理條件下，細胞自噬處于抑制狀態，但缺血初期，腦組織缺血缺氧會造成細胞自噬小體激活，發揮神經保護作用。但長時間不干預會造成機體內細胞自噬的過度激活，細胞自噬增加造成神經元損傷。本研究結果提示草果知母湯改善了I/R造成的大鼠腦中神經元損傷。

缺血再灌注過程中，細胞自噬對于神經元的存活是一把雙刃劍，其激活水平與腦缺血時間相關。初期，有效的自噬激活能夠促進神經元存活，但隨著病情進展，抑制自噬往往能帶來更多收益。Shi等〔18〕研究顯示，腦缺血3～7 d的模型大鼠，其缺血介導的腦損傷在自噬抑制劑3-MA的干預下能夠得到改善。但Yan等〔19〕研究表明腦缺血再灌注初期，激活自噬能夠有效改善腦缺血再灌注后的損傷。在自噬激活的過程中，Beclin1和LC3是自噬激活的可靠生物標記物，其中Beclin1是酵母自噬基因Atg/Vps30的同源基因，其表達的強度與自噬的激活密切相關，Beclin1表達上調是自噬過程激活的必要條件〔20〕。LC3-Ⅰ為非激活型胞質LC3，在水解和脂質化過程中變為激活LC3-Ⅱ，且與自噬小體膜結合，促進自噬小體的形成〔21〕。因此，Beclin1的敲除與抑制LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化將有助于抑制自噬體的加工，減少自噬過程的過度激活。已有研究顯示，雷帕霉素可以上調Beclin1，增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例，促進細胞自噬激活〔22〕。有趣的是，雷帕霉素是mTOR蛋白抑制劑，因此，mTOR蛋白在細胞自噬中發揮著負反饋調節作用。研究顯示，mTOR是腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)下游重要的信號分子，腦缺血時AMPK激活，進而抑制mTOR的磷酸化，造成mTOR與Unc-51樣激酶(Ulk)1的結合減少，誘導自噬的發生〔23〕。但本研究中，長期的腦缺血再灌注造成細胞的自噬程序過度激活，而草果知母湯則通過增加mTOR表達減少了下游Beclin1及LC3-Ⅱ的表達。

綜上所述，草果知母湯通過激活mTOR，減少下游Beclin1表達，抑制LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化，抑制腦缺血再灌注后的過度自噬，減少神經元凋亡，改善大鼠神經功能與認知功能損傷。