基于PI3K/AKT/mTOR信號通路的制首烏大黃素有效成分抗ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化

張磊 田維毅 王和生 賴陳岑 李妹娟 夏麗 冷傳龍

(1貴州中醫藥大學,貴州 貴陽 550002；2貴州中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室)

心血管疾病的發生和死亡呈日益增長的趨勢，作為其重要病理基礎，動脈粥樣硬化(AS)的預防與治療已成為影響人類健康的重點研究對象。AS是脂質在動脈血管內膜大量積聚使外觀呈現出黃色粥樣硬化斑塊，主要累及大、中動脈。病變過程中兩個關鍵環節：脂質積聚和炎癥反應，循環往復，相互影響〔1〕，使脂質不斷浸潤，內膜損傷加劇，最終纖維帽變薄、斑塊破損、游離，變成血栓，它是基于脂質浸潤和損傷反應理論基礎上，進一步發展的慢性炎癥疾病〔2〕。本實驗希望通過研究制何首烏大黃素通過調控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路及其通路相關因子磷酸肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)來明確其防治AS的發生發展機制，為中醫藥防治AS，開發有效、低毒副作用的抗AS藥物提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1試驗藥物和動物 大黃素購自西安飛達生物有限公司；脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；血脂康購自維信生物科技有限公司。6周齡雄性SPF級C57BL/6J小鼠12只，ApoE-/-小鼠72只，體重(20±2)g，均購自貴州醫科大學，合格證號編號為SCXK(黔)2012-0001。

1.2試劑 抗mTOR抗體、抗AKT1/AKT2/AKT3抗體、anti-PI3K p85 α抗體、抗mTOR(phospho S2481)抗體均購自美國Abcam公司；RNA純化試劑盒、蛋白Ladder均購自美國Thermo公司；高效RIPA組織細胞裂解液、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、RNAwait、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)膠促凝劑均購自北京索萊寶生物科技有限公司；免染膠試劑盒12%、7.5%，快轉液購自美國BIO-RAD公司。

1.3儀器 高速冷凍離心機購自長沙邁佳森儀器設備有限公司；超低溫冷凍冰箱購自青島海爾特種電器有限公司；全自動酶標儀購自上海賽默飛儀器有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)儀；微電腦PCR儀；化學成像發光系統；蛋白轉印槽購自美國BIO-RAD公司；電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.4方法

1.4.1造模與給藥 將72只成年雄性ApoE-/-小鼠普食喂養1 w，然后隨機分成6組：AS模型組、高、中、低劑量組、陽性對照組和大黃素中劑量+雷帕霉素組(聯合給藥組)，每組12只。正常對照組為成年健康雄性C57BL/6J小鼠12只。采用炎癥反應誘導法合并高脂飼料法進行ApoE-/-小鼠AS造模，除正常對照組外，其他6組小鼠用高脂飼料(21%豬油、0.15%膽固醇、78.85%基礎飼料)飼養，并每隔1 d腹部皮下注射脂多糖(LPS)25 μg/只，9 w后，隨機取一造模小鼠和正常小鼠主動脈，進行油紅O染色，顯微鏡下觀察主動脈形態有AS斑塊的形成證明造模成功后停止LPS給藥；給藥組小鼠基于高脂飲食，高、中、低劑量組小鼠分別按40 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg灌服大黃素，陽性對照組血脂康200 mg/kg灌胃，大黃素中劑量+雷帕霉素組(聯合給藥組)給予20 mg/kg大黃素及腹部皮下注射雷帕霉素溶液1 mg/kg，所有藥物體積0.5 ml，持續給藥6 w后取材。

1.4.2生化檢測 采用生化試劑盒，全自動酶標儀測定總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。

1.4.3組織HE染色 將主動脈血管組織脫水、浸蠟、包埋后切片，按照HE染色試劑盒說明進行透明、復水、染色、封片，在光學顯微鏡下觀察病理組織切片并做圖像采集保存。

1.4.4qRT-PCR檢測mTOR、PI3K、AKT mRNA表達水平 提取小鼠心肌組織總RNA50 μl，以RNA為模板，按試劑盒說明進行反轉錄得cDNA，根據試劑盒說明書，于冰上配制各組反應液，進行qRT-PCR反應，PI3K：上游引物：5′-GCTCCTGGAAGCCATTGAGAA-3′,下游引物：5′-CGTCGATCATCTCCAAGTCCAC-3′；AKT：上游引物：5′-AGTCCCCACTCAACAACTTCT-3′，下游引物：5′-GAAGGTGCGCTCAATGACTG-3′；mTOR：上游引物：5′-AATACGCCATGAAACACTTCG-3′，下游引物：5′-GGTCTTCCTTGTTTGTGTCCA-3′；β-actin：上游引物：5′-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3′，下游引物：5′-ATGCCACAGGATTCCATACC-3′。擴增程序：階段1：預變性，50℃，120 s，循環1次；95℃，600 s，循環1次；階段2：熱循環，95℃，15 s，60℃，60 s，循環40次；階段3：溶解曲線，65℃，5 s，95℃，5 s，循環1次。

1.4.5Western印跡檢測心肌組織mTOR、p-mTOR、PI3K、AKT蛋白表達水平 按BCA試劑盒說明書操作，根據標準曲線計算心肌蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后置于100℃水浴鍋中孵育5 min，使蛋白質變性。取等量蛋白進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電脈(PAGE)，轉移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶室溫孵育150 min。TBST洗膜3次，每次10 min。洗膜完成后孵育對應一抗4℃過夜。第2天洗膜3次，再孵育二抗1 h。洗膜3次后顯影，使用ImageJ軟件對蛋白條帶進行灰度值分析相對蛋白表達量。

1.5統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析、非參數檢驗。

2 結 果

2.1各組血脂指標水平比較 與模型組比較，給藥各組TC、TG、LDL-C水平均明顯降低(均P<0.05)。除低劑量組外其余給藥組HDL-C水平均明顯高于模型組(均P<0.05)。提示從血脂水平變化上看，制首烏大黃素對脂質代謝起一定作用，促進血清中HDL-C的合成，加速TC、TG、LDL-C的分解，有降血脂的作用。見表1。

表1 各組血脂指標水平及心肌組織mTOR、PI3K、AKT mRNA比較

2.2HE染色觀察小鼠胸主動脈病理改變 模型組內膜明顯增厚，可見大的脂質核心，斑塊纖維帽變薄并伴有破裂；高劑量組內膜稍有增厚；中劑量組內膜增厚，稍有破裂，但細胞排列整體有序；低劑量組內膜變薄，有脂質堆積，見玻璃樣變形成；陽性對照組內膜增厚，斑塊纖維帽較??；聯合用藥組內膜稍增厚，未見脂質。提示高、中劑量組和聯合用藥組對AS斑塊形成干預效果好，血管內沒有脂質堆積，未見斑塊形成，內膜未見脂質核心，而大黃素低劑量干預效果不佳。見圖1。

圖1 各組主動脈病理(HE，×400)

2.3各組mTOR、PI3K、AKT mRNA水平比較 與模型組比較，高、中劑量組、陽性對照組和聯合用藥組mTOR mRNA水平明顯降低(P<0.05)；高、中、低劑量組和聯合用藥組PI3K mRNA水平明顯降低(P<0.05)。高、中劑量組、聯合用藥組和陽性對照組AKT mRNA水平明顯降低(均P<0.05)。見表1。提示制首烏大黃素對mTOR、PI3K、AKT mRNA起抑制影響，但低劑量無明顯作用。

2.4各組心肌組織PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白水平比較 與模型組比較，高、中劑量組、聯合用藥組PI3K蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；高、中劑量組AKT蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。高、中、低劑量血、陽性對照組和聯合用藥組mTOR蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。高、中、低劑量組和聯合用藥組p-mTOR蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。提示一定劑量的制首烏大黃素對PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達有抑制作用。見表2、圖2。

表2 各組心肌中PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表達水平比較

1～6：模型組；高劑量組；中劑量組；低劑量組；陽性對照組；聯合用藥組圖2 各組心肌組織PI3K、AKT、mTOR、p-mTOR蛋白水平

3 討 論

AS發病機制復雜，與炎癥、免疫、氧化應激、脂質代謝等有關〔3〕。自噬發生在真核細胞內，是自身物質成分被溶酶體所降解的過程〔4〕。細胞自噬與脂代謝可以相互影響，細胞自噬降解脂質，還能調節膽固醇逆向轉運〔5〕。AS的發病機制也與自噬有關，mTOR是影響巨噬細胞發生自噬的抑制因子，通過抑制其活化可刺激機體自噬的增加，p-mTOR作為mTOR磷酸化蛋白，是判斷通路活化的判定標準。在AS病理發展過程中，mTOR信號通路被激活，促進細胞增殖、遷移，擴大炎癥反應，誘導脂代謝紊亂，調控細胞免疫應答等〔6〕。有研究表明，在LPS誘導下，mTOR信號通路激活〔7〕。巨噬細胞通過自噬，調節胞內環境穩態，拮抗細胞凋亡，從而發揮穩定AS斑塊的影響〔8〕。mTOR相關抑制劑是雷帕霉素〔9〕，可抑制平滑肌細胞增殖。

大黃素是制何首烏游離蒽醌的主要成分，可通過降脂、抗炎等達到抗AS的作用，且在相互作用中調節多條信號通路，如ABCA1、NF-κB、JAK/STAT3等信號通路〔10，11〕。其中，mTOR涉及細胞炎癥與自噬的調控中樞，也受到了影響。本研究結果表明制何首烏大黃素對ApoE-/-小鼠AS模型中的病變有明顯療效，能夠降低血清中TC、TG、LDL-C的含量，升高HDL-C的含量，起到調節血脂及保護血管的作用，且能夠抑制mTOR信號通路及mTOR信號通路上游PI3K/AKT信號活性，刺激機體自噬增加，增加糖脂的代謝，從而達到抗AS的作用，為中藥治療AS提供了新視角。