間充質干細胞外泌體對心力衰竭大鼠心肌細胞的影響及機制

班努·庫肯 巴·巴音斯勒瑪 木胡牙提·烏拉斯汗 劉兆平

(新疆醫科大學 1第二附屬醫院心內科，新疆 烏魯木齊 830063；2第五附屬醫院心內科；3第一附屬醫院心內科；4北京大學第一醫院心內科)

心力衰竭(心衰)是指心臟的泵血功能不能隨著機體需求的增加而增加，使得血液循環不能滿足機體生理需求的病理過程〔1〕。心衰是所有心血管疾病的最終歸宿〔2〕，也是心血管疾病患者死亡的主要原因，臨床上治療心衰的藥物有許多種，但是對于心衰晚期仍然缺少有效的治療藥物，因此，尋找有效的創新藥物或者治療靶點對于心衰的治療至關重要。外泌體是一類由活細胞分泌的粒徑在30～150 nm的納米級囊泡〔3〕，內含DNA、RNA、脂質、蛋白質等生物活性物質〔4〕，可作為細胞間信息傳遞的載體〔5〕。其中，間充質干細胞來源的外泌體已經被報道對多種疾病的發展均有治療作用〔6,7〕，包括治療心肌梗死等心血管疾病〔8,9〕，但是其對心衰的影響及機制未有明確的報道。本研究探究了間充質干細胞外泌體對心衰大鼠心肌細胞的影響及機制。

1 材料與方法

1.1材料 健康清潔級SD大鼠30只(新疆醫科大學)；CCK8試劑盒(沈陽萬類生物技術有限公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物技術有限公司)；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-9、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、GAPDH抗體，山羊抗鼠二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)；電泳儀(南京大學儀器廠)；微型垂直電泳槽(上海天能科技有限公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。牛血清白蛋白(BSA)，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，增強化學發光劑(ECL)，磷脂結合蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)試劑盒(沈陽萬類生物技術有限公司)。

1.2間充質干細胞的分離、培養與鑒定 將3周齡SD雌性大鼠頸椎脫臼處死，解剖取股骨和脛骨，并剪去兩端，露出骨髓腔，使用含10%的胎牛血清的培養液，沖洗骨髓腔，反復2次，打散細胞懸液后，使用70 μm細胞篩過濾，去除細胞團塊。用相對密度1.077的淋巴細胞分離液稀釋，2 000 r/min，離心30 min，收集單核細胞界面層，然后1 000 r/min，離心10 min，棄上清后，使用原代細胞培養液重懸細胞，細胞懸液接種于100 mm2細胞培養皿中，在37℃，5%的CO2培養箱中培養48 h，除去未貼壁的細胞，每隔2 d換液或者傳代。

采用流式細胞儀鑒定間充質干細胞，具體步驟為：消化并調整細胞密度為1×106/ml，取100 μl的細胞懸液于流式管中，分別加入待測抗體CD29、CD90、CD11B、CD45，并設置相應的同型抗體對照組，4℃避光孵育30 min，清洗2次后，除去上清，0.5 ml固定液重懸，進行流式細胞儀檢測，間充質干細胞應表達CD29和 CD90，而不表達CD11B和CD45。

1.3間充質外泌體的提取 使用含10%的無外泌體胎牛血清的培養基培養間充質干細胞48 h，收集細胞培養上清，采用差速離心法提取間充質干細胞外泌體，具體步驟為：將所收集的細胞上清分裝到10 ml的離心管中，首先3 000 r/min，4℃離心15 min，去除死細胞；然后6 000 r/min離心40 min，去除細胞碎片；10 000 r/min離心1 h，取上清；100 000 r/min離心1 h，收集沉淀即為外泌體，用400 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸外泌體，并放在-80℃保存。

1.4間充質干細胞外泌體的鑒定 采用透射電鏡觀察外泌體的形態結構，具體步驟為：取100 μl外泌體加入50 μl的放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液，于冰上裂解30 min，12 000 r/min，離心15 min后，取上清，即為外泌體總蛋白。采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，并稀釋外泌體至蛋白濃度為0.5 mg/ml。將透射電鏡所用的銅網平放到稱量紙上，滴加20 μl上述外泌體溶液，于紅外燈下烘烤10 min；烘干后再滴加2滴磷鎢酸，繼續烘烤10 min，吸走多余液體，于投射電鏡下觀察外泌體結構。

Western印跡檢測外泌體表面生物標志物CD9、CD63、TSG101，具體步驟為：取外泌體蛋白裂解液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，經轉膜，封閉后CD9、CD63、TSG101一抗孵育過夜，然后二抗孵育，洗膜后，曝光成像。

1.5心衰大鼠造模 30只SD大鼠適應性飼養1 w后，隨機分為假手術組和心衰組，心衰組大鼠進行左冠狀動脈前降支結扎術，方法如下：腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，備皮，局部消毒，先用10號縫線在開胸部位做一荷包，迅速開胸暴露心臟，模型組用0號線結扎左冠狀動脈前降支，假手術組僅穿線不結扎。術后迅速收攏荷包關閉胸腔，手術部位涂敷0.2%呋喃西林軟膏，并常規給予腹腔注射青霉素(200 000 U/kg)7 d。術后4 w模型組存活大鼠麻醉后于左胸上至鎖骨下至肋骨下緣處備皮，對大鼠射血分數(EF)進行檢測；通過RM-6000型八通道生理記錄儀進行血流動力學檢測，記錄左心室收縮期末壓(LVESP)，左心室舒張期末壓(LVEDP)及左室內壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)。

1.6大鼠心肌細胞的分離與培養 取假手術和心衰組大鼠，麻醉后迅速解剖取心臟，用提前預冷的KH液清洗心臟，使用Langendroff 灌流裝置，先后用KH 液、低鈣液、酶液灌流，然后將心肌組織均勻的剪成碎片，震蕩，過濾，用KH液(Ca)沖洗兩次復鈣，然后用含有10%胎牛血清的M199培養基培養。

1.7CCK8檢測細胞增殖 取假手術組大鼠的心肌細胞和心衰組大鼠的心肌細胞于6孔板中培養，假手術組大鼠的心肌細胞作為對照組，心衰組大鼠心肌細胞分為兩組：模型組和外泌體組，外泌體組心肌細胞用2 μg外泌體共孵育24 h，而模型組和對照組分別與等體積的PBS共孵育，共孵育后消化并稀釋細胞至50 000個/ml，將上述細胞接種至96孔板，每孔100 μl，每組三個復孔，并將細胞培養2～4 h，使各組心肌細胞完全貼壁，然后每孔加入10 μl的CCK8溶液，繼續37℃培養，分別于24 h、48 h、72 h用酶標儀檢測各孔450 nm處的吸光度，OD值越大，細胞增殖能力越強。

1.8細胞凋亡實驗 取對照組、模型組和外泌體組細胞5×105個于6孔板中，外泌體組每孔與2 μg間充質干細胞外泌體共孵育24 h，對照組和模型組用等體積的PBS共孵育24 h。孵育后，消化各組細胞，用2 ml 1×結合緩沖液重懸細胞，稀釋并調整細胞密度1×106個/ml，分裝細胞于離心管中，每管100 μl，每管細胞分別加入Annexin V-FITC抗體5 μl和碘化丙啶(PI)抗體5 μl，室溫避光反應15 min，然后加入400 μl 1×結合緩沖液，流式進行檢測。

1.9Western印跡檢測Bcl-2、Caspase-9表達水平 取各組共孵育后的心肌細胞加入1 ml蛋白裂解液，冰上裂解30 min，然后12 000 r/min，離心15 min，取上清即為總蛋白，BCA蛋白定量后加入上樣緩沖液，沸水浴5 min，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，用5%的BSA對其封閉2 h，然后以稀釋后的GAPDH、Caspase-9、Bcl-2一抗4℃孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照增強化學發光劑(ECL)試劑盒說明書配制發光液，并將PVDF膜浸入發光液中反應30 s，曝光并拍照，用photoshop軟件曝光結果進行定量分析。

1.10統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行方差分析，LSD法。

2 結 果

2.1間充質干細胞鑒定結果 根據流式細胞儀檢測結果(圖1)，所提取到的間充質干細胞CD29、CD90表達的陽性率分別為98%和97%，CD11B和CD45表達的陽性率分別為3.8%和2.0%，提示所提取的間充質干細胞符合實驗要求，且均一性良好。

圖1 流式細胞儀檢測CD29、CD90、CD11B、CD45表達

2.2外泌體鑒定結果 如圖2所示，透射電鏡觀察到采用差速離心法提取到的囊泡具有雙層膜結構，“杯托”樣，粒徑30～150 nm，與外泌體結構一致；Western印跡結果顯示，差速離心法提取到的外泌體表達生物標志物CD63、CD9、TSG101。

圖2 外泌體鑒定結果

2.3各組大鼠血流動力學檢測指標 與假手術組比較，心衰組LVESP顯著降低(P<0.001)，LVEDP顯著升高(P<0.01)，+dp/dtmax，-dp/dtmax、EF顯著降低(P<0.01，P<0.001)，見表1。

表1 各組造模后血流動力學檢測指標比較

2.4間充質干細胞外泌體促進心衰大鼠心肌細胞增殖 模型組心肌細胞OD值顯著低于對照組(P<0.05,P<0.001)；外泌體組心衰大鼠心肌細胞OD值顯著高于模型組(P<0.01,P<0.001)。見表2。

表2 各組心肌細胞OD值比較

2.5間充質干細胞外泌體抑制心衰大鼠心肌細胞凋亡 與對照組〔(11.33±1.53)%〕比較，模型組心肌細胞凋亡率〔(20.33±1.52)%〕顯著增加(P<0.001)；與模型組相比，外泌體組心肌細胞凋亡率〔(15.00±1.00)%〕顯著降低(P<0.001)。見圖3。

圖3 流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡

2.6間充質干細胞外泌體上調Bcl-2的表達和下調Caspase-9的表達 模型組心肌細胞Bcl-2表達顯著低于對照組，Caspase-9表達顯著高于對照組(均P<0.001)；與模型組相比，外泌體組Bcl-2表達顯著增加，Caspase-9表達量顯著降低(均P<0.001)。見圖4，表3。

圖4 Western印跡檢測各組心肌細胞Bcl-2和Caspase-9的表達

表3 各組心肌細胞Bcl-2和Caspase-9表達水平比較

3 討 論

心力衰竭是各種心血管疾病發展到中晚期的病理狀態，是造成心血管患者死亡的主要原因〔10〕，流病學研究顯示目前全球心衰患者的人數高達2 250萬人，并仍以每年200萬的速度遞增〔11〕，且5年存活率與惡性腫瘤相似，且藥物和手術的治療方法并不能有效治療心衰，所以探究新的心衰治療方法至關重要。外泌體作為細胞間信息交流的載體，可向靶細胞傳遞生物信息物質，調控靶細胞的病理狀態，研究表明，間充質干細胞外泌體能夠攜帶間充質干細胞的信息物質，在間充質干細胞的旁分泌中起到重要的作用〔12〕，但間充質干細胞能否通過外泌體影響心衰的病理進程，尚無詳細報道。

心衰的主要病理特征包括心肌肥厚、心肌壞死、心肌凋亡、心肌纖維化，其中心肌壞死和心肌凋亡導致心臟代償能力喪失，最終導致心臟泵功能喪失〔13〕。本研究提示間充質干細胞或可通過抑制心肌細胞的凋亡來緩解心衰。

細胞凋亡是一種受機體調控的自殺機制，通常表現為核濃縮、起皺及DNA片段化等，Caspase家族屬于半胱氨酸蛋白酶，與促凋亡信號緊密相連，一旦凋亡信號被激活，效應Caspase就會對細胞中靶蛋白的天冬氨酸殘基進行切割，調控細胞的凋亡，Caspase-9是Caspase蛋白家族成員之一，主要起到中樞控制細胞凋亡的作用，通過促進細胞凋亡而影響生命進程〔14〕；本研究發現，間充質干細胞分泌的外泌體能夠顯著下調心衰大鼠心肌細胞中Caspase-9的表達。Bcl-2家族蛋白可以通過抑制線粒體膜的通透性來調控細胞凋亡，抗凋亡蛋白Bcl-2定位于線粒體外膜上，當其接受到凋亡信號時會抑制線粒體釋放細胞色素C；細胞質的細胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關因子(Apaf)-1結合，使其形成多聚體，并促使Caspase-9與其結合形成凋亡小體，Caspase-9被激活，被激活的Caspase-9能激活其它的Caspase，從而誘導細胞凋亡〔15〕，所以Bcl-2可通過抑制線粒體釋放細胞色素C來發揮其抑制凋亡的作用，Bcl-2能夠抑制免疫細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、心肌細胞的凋亡，本研究發現，間充質干細胞外泌體能夠顯著上調Bcl-2的表達而抑制心衰大鼠心肌細胞的凋亡。