CXCR2抑制劑在視神經脊髓炎大鼠模型中的作用

李露 王衛紅 劉洪濤 任薈璇 梁倩 李姍 蔡善君

(遵義醫科大學附屬醫院眼科，貴州 遵義 563000)

視神經脊髓炎譜系疾病是一種毀滅性的自身免疫性疾病，可能導致失明和癱瘓〔1〕。視神經脊髓炎譜系疾病與其他脫髓鞘疾病(如多發性硬化癥)在病理學上存在不同，區別在于其水通道蛋白(AQP)4抗體的存在〔2,3〕。此外，中性粒細胞和其他粒細胞也存在于脊髓和視神經的病變中，可能導致永久性髓鞘、膠質細胞和神經元的損傷〔4〕。中性粒細胞作為視神經脊髓炎疾病效應通路的關鍵因素，已被納入臨床試驗干預的目標〔5,6〕。視神經脊髓炎動物模型表明，中性粒細胞在病變發展中起重要作用，且抑制中性粒細胞可降低病變的嚴重程度及大小〔7〕。CXCR2是白細胞介素(IL)-8、CXCL1和GRO-β的受體，由中性粒細胞分泌，可以作為一種化學引誘劑，將中性粒細胞召集到損傷和炎癥部位。本研究在視神經脊髓炎大鼠模型中用CXCR2抑制劑SCH527123來抑制中性粒細胞召集所產生的效果，旨在探討CXCR2抑制作用對中樞神經系統免疫損傷程度的影響。

1 材料與方法

1.1實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠的誘導 所有動物實驗經委員會批準。雌性Lewis大鼠15只，7～8周齡，130～150 g。豚鼠10只，雌雄不拘，體重300～400 g，均購于上海實驗動物中心。大鼠隨機分為EAE空白對照組、EAE大鼠藥物治療組、EAE大鼠抑制劑組各5只。

1.2EAE大鼠誘導 豚鼠處死后，迅速取出脊髓，用0.9 g/L生理鹽水制成0.5 kg/L豚鼠全脊髓勻漿，再與等量的完全弗氏佐劑(Sigma Aldich公司)混勻后制成油包水型乳劑。每只大鼠皮下注射100 μl，對大鼠進行EAE誘導。所有大鼠進行稱重，從第5天開始每天觀察狀態并評分。

1.3評分標準 0分：無明顯異常；0.5分：尾巴略微無力或步態略有異常；1.0分：尾巴無力或尾巴略微無力且輕度后肢麻痹；1.5分：尾巴無力且后肢輕度麻痹；2.0分：尾巴無力伴中度后肢麻痹；2.5分：后肢麻痹，但有部分腿部活動；3.0分：后肢麻痹且無活動；3.5分：后肢麻痹且前肢輕度麻痹；4.0分：四肢完全麻痹，但頭部有一定活動；4.5分：垂死；5.0分：死亡。當大鼠評分>3.5分后1 d，或達到4分，動物則被處死。

1.4視神經脊髓炎抗體(NMO-IgG)的準備 從3例接受復發治療的AQP4抗體陽性血清患者血漿去除術后捐贈的血漿中獲得抗體IgG，其中包括AQP4抗體(AQP4 IgG即NMO-IgG)，將其保存至-80℃備用。將血漿在磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后，過濾，將澄清液裝入Protein G Sepharose(Biovision公司)柱中，PBS沖洗，用0.1 mol/L甘氨酸-鹽酸溶液(pH 2.6)，合并在280 nm下具有大于5倍背景吸光度的洗脫液，并使用Amicon旋轉過濾器(50 KDa MWCO，15 ml;Millipore)將溶劑轉換至PBS。將最終體積用PBS調節至7～10 ml。

1.5AQP4抗體注射或藥物治療大鼠 在收集大鼠組織前3～4 d腹腔注射空白對照(0.5%羥丙基甲基纖維素)或CXCR2抑制劑SCH527123。于收集大鼠組織前2 d腹腔注射患者IgG，每只動物在這兩天中的每一天劑量為12 mg。大鼠于最后1次注射后的第2天被處死。藥物治療組大鼠在免疫后的第8天和第10天使用甲潑尼龍醋酸酯(Depo-Medrol)進行治療(10 mg/kg，皮下注射，輝瑞公司)。

1.6組織收集、包埋和切片 采用20 g/L烏拉坦經動物腹腔注射深麻醉，以生理鹽水經左心室灌注去除血管內皮細胞直至流出清色液體。再用4℃的40 g/L多聚甲醛500 ml灌注固定，然后立即取脊髓置0.2 kg/L蔗糖(0.1 mol/L PB)浸泡至沉底后于-20℃連續橫斷面切片，片厚約20 μm，切片放入0.01 mol/L PBS于4℃保存備用。

1.7免疫組織化學 冷凍切片入0.3%過氧化氫(H2O2)溶液于室溫下孵育30 min；每張切片加 1滴非免疫動物血清于室溫孵育5 min，棄去血清，不洗；切片分別與Goat anti Human IgM(Alk Phos)(1∶250)、多克隆抗體抗GFAP(1∶250)于37℃孵育1 h并在4℃下過夜(抗GFAP 4℃過夜)；每張切片加1滴生物素標記的2抗于37℃孵育30 min；再加1滴鏈親和素-過氧化物酶在室溫下孵育20 min；最后經二氨基聯苯胺(DAB)顯色；顯微鏡下觀察，顯色3～10 min；梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。各步前用0.1 mol/L PBS(pH 7.4)沖洗5 min、3次。第7～9步后均用0.5 mol/L PBS洗滌5 min、4次。

1.8定量免疫組織化學分析 計數每張切片脊髓內隨機4個高倍視野(400倍)陽性細胞數，采用ImageProPlus5.1軟件測定各組織切片總面積(每只大鼠8～10個軸向脊髓切片)和免疫反應總面積，對同一批次染色的所有切片采用相同顏色進行定量。

1.9統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗，并采用GraphPad Prism軟件進行分析。

2 結 果

2.1大鼠行為結果 在短時間內，視神經脊髓炎患者IgG的注射并沒有顯著加重實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的評分。相反，注射IgG前Depo-Medrol治療相對空白對照組顯著降低了實驗性自身免疫性腦脊髓炎的發生(P<0.05)。見表1。一旦觀察到早期癥狀，EAE的行為特征就會迅速發展，通常從免疫后第10天或第11天開始，從1.0分(尾巴無力)到3.0分(后肢完全麻痹)時間僅為24 h。在注射IgG當天，大鼠脊髓中人抗體的免疫組化信號最強為1.0～2.0，第2天評分則≥2.5分。

表1 免疫后各組不同時間大鼠評分分)

2.2脊髓病理結果 與空白對照組(0.59±0.07)%相比，SCH527123處理的動物中樞神經系統中性粒細胞的積累(0.28±0.02)%顯著減少，Depo-Medrol治療(0.29±0.08)%也減少了中性粒細胞的流入(P<0.05)。與空白對照組(0.92±0.52)%相比，SCH527123組(0.56±0.42)%、Dopo-Medrol組(0.25±0.14)%并沒有減少AQP4損耗的病灶面積(P>0.05)，見圖1，圖2。

圖1 EAE大鼠脊髓中中性粒細胞的實例(HE，×400)

圖2 AQP4的損耗(免疫組化，×200)

3 討 論

視神經脊髓炎大鼠模型是用于測試中性粒細胞在免疫介導神經脊髓炎損傷病理中的有效模型〔8〕。在該模型中，AQP4抗體特異性結合大鼠中樞神經系統星形膠質細胞，導致抗體介導的星形膠質細胞病，與人類疾病病理一致〔9〕。

本研究結果表明，接受SCH527123的大鼠沒有明顯改善。然而，該模型可能并不適合對該項目進行評估。此外，注射AQP4 IgG后，大鼠也未顯示出顯著的神經功能惡化。但有研究表明，AQP4 IgG可加重EAE大鼠的行為評分〔10,11〕。推測本文結果的差異可能是由于其他研究者使用的AQP4 IgG毒性不同。中性粒細胞是抵御入侵病原體的第一線防御，其利用Fc-和補體受體驅動的通路將有毒顆粒物質和氧自由基推向靶細胞〔12〕。中性粒細胞還侵入各種損傷模型中的組織，且在修復中可以具有正面和負面作用，這取決于組織和損傷。如中性粒細胞通過促進中樞神經系統中的膠質瘢痕而阻礙脊髓損傷后的功能恢復〔13〕，但也被證明通過吞噬功能促進周圍神經系統的修復〔14〕。中性粒細胞和CXCR2中性粒細胞表達對EAE的發生發展和脫髓鞘的進展至關重要〔15～17〕。雖然本研究中使用SCH527123處理減少中性粒細胞累積高達60%并未顯著保護星形膠質細胞免受損傷，但低水平的中性粒細胞參與可能足以與經典補體途徑配合以引發損傷。

本研究使用CXCR2抑制劑抑制中樞神經系統中性粒細胞的總量。據報道，許多類型細胞可表達CXCR2，包括T細胞、巨噬細胞和內皮細胞的亞群〔18〕。在CXCR2缺失小鼠中，主要表現是中性粒細胞遷移。在EAE Lewis大鼠模型中，除了中性粒細胞，沒有觀察到任何其他細胞類型的遷移減少。CXCR2也在非造血細胞中表達，這可能對中樞神經系統脫髓鞘模型有影響。如CXCR2在少突膠質細胞前體細胞上表達，通過干擾其擴張和遷移來限制髓鞘再生〔19〕。視神經脊髓炎Lewis大鼠模型也有兩個顯著的局限性。首先，疾病過程由髓鞘反應性T細胞啟動，其不是AQP4特異性。其次，AQP4特異性取決于視神經脊髓炎患者的人IgG組分。針對大鼠AQP4的單克隆抗體會導致EAE大鼠誘導形成大量的AQP4病變，而人IgG則對EAE大鼠引起的病變程度相對較小。這可能是由于人抗體對大鼠AQP4的親和力較低〔9〕。或可能是由于抗體毒性模式的標本特異性差異，這可能影響通過僅靶向中性粒細胞來阻斷星形膠質細胞損傷的能力。

綜上，通過CXCR2拮抗劑阻止中性粒細胞遷移進入中樞神經系統是成功的，但并未抑制視神經脊髓炎患者IgG對AQP4引起的病變。CXCR2抑制作用可能不僅有益于中性粒細胞參與的、自身免疫介導的中樞神經系統疾病的治療，其具體機制和作用有待進一步探討。