行為學干預對血管性癡呆大鼠腦組織保護及CXCR4、β-catenin表達的影響

呂威力 邢雪松

(沈陽醫學院 1病理學教研室，遼寧 沈陽 110034；2解剖學教研室)

缺血性腦損傷具有高發病率、高致殘率、高死亡率的特點，是嚴重危害人類健康的疾病〔1～3〕。研究已經證實腦缺血能促進成年動物腦內神經干細胞(NSCs) 的增殖、遷移和分化，部分受損的神經元可被分化的新生神經元代替，從而在一定程度上改善神經功能缺損〔4〕。神經營養因子是一類可對神經元起調節作用的多肽分子。它不止能夠調節神經元細胞的增殖分化，并且在腦組織缺血之后，保護受到再灌注損傷神經元，對神經元損傷后的修復及再生發揮重要作用〔5～7〕。腦源性神經生長因子(BDNF)和膠質源性神經營養因子(GDNF)屬于神經生長因子家族。研究發現，大腦中BDNF和GDNF的釋放對缺血性和缺氧性腦損傷具有修復作用。本研究采用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法制作大鼠血管性癡呆模型，研究缺血后海馬CXCR4和β-catenin的變化及氣味穿梭訓練的干預效果，探討氣味穿梭訓練干預對血管性癡呆大鼠腦組織保護及CXCR4、β-catenin表達的影響。

1 材料和方法

1.1血管性癡呆模型的制備 54只健康雄性wistar大鼠，8周齡，體重(230±10)g，購于沈陽醫學院實驗動物中心。將大鼠隨機分為3組：假手術組(n=6)，模型組(3、7、14、21 d，n=6)，訓練組(3、7、14、21 d，n=6)。采用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法建立血管性癡呆大鼠模型。術前12 h禁食、4 h禁水。術前麻醉采用1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射，取仰臥位固定實驗動物，常規消毒，頸正中切口2～3 cm，分離雙側頸總動脈(CCA)，夾閉10 min后再通10 min，需重復上述過程2次，分離時應小心避免拉扯大鼠的迷走神經，模型組大鼠在夾閉頸總前腹腔注射硝普鈉(2.5 mg/kg)。術后放回籠中保溫飼養，應用慶大霉素防止大鼠局部感染。實驗過程中應用多導生物記錄儀在測量并記錄血壓數值，大鼠在注射硝普鈉前動脈壓平均約為100 mmHg，注射硝普鈉后血壓平均值迅速下降至50～55 mmHg左右約持續2 min，后血壓平均值緩慢上升至70 mmHg持續1 h。在建立血管性癡呆模型過程中保持大鼠肛溫維持在(37±1)℃，目的防止溫度降低對腦缺血損傷產生保護。假手術組分離雙側頸總動脈后不夾閉血管，也不應用硝普鈉降壓，余同模型組。造模1 d后訓練組開始進行氣味訓練，此后分別于3、7、14、21 d處死取材。

1.2氣味穿梭訓練 建模成功1 d后開始進行氣味穿梭訓練，實驗條件刺激為乙酸異戊酯氣味，非條件刺激為電擊。造模成功的大鼠需要在穿梭箱內進行暗適應，適應10 min后開始氣味刺激，刺激氣味使大鼠聞到后逃向穿梭箱另一側，如果未逃向穿梭箱另一側則在箱底給予電刺激，電流為5～10 mA，大鼠逃離到穿梭箱底另一側后電流停止，否則箱底持續受通電5 s。等待刺激氣味散去后開始下一輪訓練，每次穿梭訓練進行20次上述訓練。

1.3行為學評分 大鼠造模完成后先進行模型篩選，按照Zea Longa評分標準進行神經行為學評分，0分：無神經功能損傷；1分：大鼠前爪不能完全伸展；2分：大鼠行走時向兩側晃動；3分：大鼠行走時身體向兩側傾倒；4分：不能行走，存在意識喪失。0分和4分為建模失敗被剔除，實驗過程中保持各亞組均為6只大鼠。

1.4BNDF和NGF含量的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測 取各組大鼠腦組織進行ELISA檢測，先應用1%戊巴比妥鈉過量麻醉，快速斷頭冰上取腦，剝離大鼠大腦雙側皮質，冰生理鹽水沖洗，用濾紙吸干后稱重，保存在-80度。每組取缺血腦組織，加入生理鹽水制成10%的大鼠腦組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液待用。可保存于-80℃冰箱內待測。按照說明書進行ELISA法檢測各組大鼠腦組織BNDF和GDNF的含量。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 造模3 d后，取各組大鼠海馬組織，HE染色法鏡下觀察大鼠海馬組織學改變。

1.6CXCR4和β-catenin的Western印跡法檢測 首先取各組大鼠海馬組織，20 mg海馬組織加入200 μl裂解液，快速剪碎組織，冰上裂解半小時，充分裂解后4℃離心12 000 r/min,10 min，取上清液。先測定蛋白濃度確定上樣量。電泳分離蛋白恒壓80 V 1.5～2.0 h，轉膜恒壓70 V轉 2 h，牛奶室溫封閉40 min，一抗(CXCR4 1∶200或β-catenin 1∶200)4℃孵育過夜，1×TBST洗膜3～4次，每次10～15 min，二抗25℃孵育2 h，1×TBST洗膜3～4次，每次10～15 min，采用超敏化學發光試劑。曝光2～5 min后保存圖片，應用Image J軟件對目的蛋白條帶進行灰度值測定，檢測各組大鼠腦組織CXCR4和β-catenin的表達情況。

1.7統計學處理 采用SPSS12.0進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1HE染色評估組織學改變 假手術組腦組織結構清晰，神經元排列整齊、數量密集；模型組的細胞腫脹，分布不均，細胞周圍的間隙變寬，神經元變性；相較于模型組，通過氣味穿梭箱訓練后海馬組織神經元存活的數量增多，神經元的腫脹減少，細胞形態有顯著改善(圖1)。

圖1 HE染色檢測各組缺血再灌注3 d海馬組織學改變(×400)

2.2BNDF和NGF含量 與假手術組比較，其余兩組腦組織中BNDF和NGF含量明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，訓練組腦組織BNDF和NGF含量明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組腦缺血后腦組織中BNDF和NGF含量

2.3氣味訓練對CXCR4的影響 假手術組海馬組織僅見CXCR4微量表達。模型組7 d時，缺血海馬CXCR4表達較前明顯增多，之后隨著缺血再灌注后時間延長CXCR4表達呈減少趨勢。 訓練組與模型組比較，3、7、14、21 d CXCR4表達均明顯增多(P<0.05)。見圖2，表2。

2.4氣味訓練對β-catenin的影響 假手術組海馬組織β-catenin有微量表達。模型組7 d、14 d β-catenin含量較3 d顯著增加，21 d β-catenin較14 d顯著下降(P<0.05)。訓練組3、7、14、21 d β-catenin表達均較模型組顯著增加(P<0.05)。模型組3、7、14、21 d β-catenin表達較假手術組顯著增加(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 Western印跡法檢測缺血再灌注海馬CXCR4和β-catenin的表達

表2 各組腦缺血后不同時間海馬組織CXCR4及β-actenin表達的光密度值

3 討 論

血管性癡呆VD是由一系列腦組織缺血和缺氧引起的癡呆綜合征，以智力減退、表情冷漠、性格和情緒轉變為主要臨床表現〔8，9〕。本研究表明，氣味穿梭箱訓練可以降低訓練組大鼠的神經行為學評分，可以提高BNDF和GDNF在腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中的含量。由此可以推測，氣味穿梭訓練可以通過提高BDNF的表達從而發揮對于缺血腦組織保護的作用。

CXCR4是基質細胞衍生因子(SDF)-1的唯一受體，是由352個氨基酸構成的具有七跨膜 G 蛋白耦聯受體。主要表達于外周血淋巴細胞、樹突細胞、神經元及血管內皮細胞等。CXCR4參與體內多種生理和病理機制，包括參與胚胎發育、造血功能、人類免疫缺陷病毒(HIV)-1 侵染和腫瘤增殖侵襲等。研究發現敲除小鼠SDF-1 或 CXCR4 基因后，在個體發育過程中顆粒細胞分布在小腦的異位位置和海馬齒狀回的形態發生改變；SDF-1/CXCR4 軸是形成大腦皮層的γ-氨基丁酸(GABA)中間神經元的募集者〔10〕。研究發現CXCR4 的表達在體外和體內均可被微小RNA-9抑制，通過調控CXCR4表達抑制 Wnt/β-catenin 信號通路進而抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖，說明SDF-1/CXCR4信號通路影響Wnt/β-catenin通路并起重要作用〔11〕。

Wnt/β-catenin 信號通路在神經再生領域里起重要作用。在干細胞表面Wnt 蛋白信號和Frizzled受體及低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRPs)的結合，通過召集基因轉移酶(KAT3)的活化因子環磷腺苷應答元件結合蛋白(CREB)錨定蛋白(CBP)激活轉錄因子 β-catenin 的轉錄，從而促進干細胞分化相關基因的表達〔12，13〕。

研究表明〔14〕，模型組大鼠缺血再灌注后第3 d海馬神經干細胞數開始增加，隨著再灌注后時間的延長逐漸增多，在缺血再灌注后的第7天時神經干達到高峰，隨后又慢慢減少，表明血管性癡呆大鼠海馬可以新生神經元。大鼠腦缺血再灌注后時間的增加，CXCR4 7 d持續高表達水平，β-catenin的表達逐漸增加，在14 d時表達水平最高。CXCR4和β-catenin的表達具有時間依賴性，分析內源性神經干細胞增殖進程，說明這兩種蛋白在神經干細胞增殖中都起到了調控作用。另外，本次實驗還觀察氣味穿梭箱訓練對于大鼠腦缺血再灌注后CXCR4和β-catenin表達的影響。從實驗數據可以得出結論，與模型組相比，訓練組大鼠海馬CXCR4和β-catenin表達明顯增加，從另一方面探討氣味訓練對神經干細胞增殖分化的作用機制。