乙醛脫氫酶2抑制4-HNE對心肌梗死模型大鼠的影響及作用機制

余永紅 楊柳 杜艷華

(武漢市第四醫院老年病科，湖北 武漢 430000)

目前臨床中主要是通過減小患者心肌梗死的面積來達到治療心肌梗死的目的，從而減輕患者心肌損傷程度，降低患者死亡率〔1〕。心肌梗死患者主要的臨床癥狀是胸骨后疼痛，大部分患者會伴有心律失常、心力衰竭等并發癥。數據顯示，我國每年會新增60萬例左右的心肌梗死患者，因此尋找安全有效的治療方式至關重要〔2〕。乙醛脫氫酶(ALDH)2屬于一種氧化乙醛酶主要存在于線粒體中，促織乙醛形成乙酸，并且對4-羥基壬烯醛(HNE)有分解作用，能夠降低毒性醛類對細胞的損傷。相關研究指出，ALDH2活性減弱會阻礙乙醛分解，提高機體中乙醇代謝產物的濃度，造成乙醛在血液中凝聚，通過刺激肥大細胞，促使血管中活性物質釋放，導致患者臉紅、發音困難、低血壓、出汗等癥狀發生〔3,4〕。4-HNE是脂質過氧化反應重要的醛基產物，在心肌中是主要的代謝酶抑制，促進破壞性蛋白在線粒中聚積，誘導產生ATP，對開放線粒體通透性轉換孔有促進作用〔5〕。本文旨在研究ALDH2抑制4-HNE對心肌梗死模型大鼠的影響及作用機制，為其臨床治療提供數據支持。

1 對象與方法

1.1材料 研究動物：32只SD健康雄性大鼠，由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供，大鼠動物合格證號:11401500014592。鼠齡8～10周齡，平均(9.8±1.2)周齡，體重200～220 g,平均(210.4±5.2)g。所有大鼠在無病原菌的干凈籠子里喂養，飲用水和食物均進行過消毒。本文研究經過醫院倫理委員會批準。主要試劑：鼠抗人c-Jun氨基末端激酶(JNK)、細胞外調節蛋白激酶(ERK)、p53單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司提供)。

1.2方法

1.2.1心肌梗死模型建立 參考靳文學等〔6〕文獻，并進行適當修改。選取24只大鼠建立心肌梗死模型，具體操作步驟：使用濃度1%的40 mg/kg戊巴比妥鈉將大鼠麻醉，進行常規消毒后固定，氣管插管，使用動物呼吸機維持大鼠呼吸，選擇大鼠左胸第3和4段肋骨用剪刀橫切，再用鑷子分離后打開胸腔，使心臟充分暴露。心包膜剪開后，使用10號醫用縫合線將冠狀動脈前支結扎，待心臟搏動減弱，Ⅱ導聯心電圖開始變化，ST段出現明顯上抬，直到抬高到弓背向上，即為造模成功。分為模型組、ALDH2過表達組、ALDH2沉默組各8只，正常組8只。

1.2.2心功能指標檢測 采用超聲心動圖檢查大鼠的心功能，10%的水和氯醛溶液0.3 ml/kg進行腹腔注射，大鼠麻醉后，采取仰臥固定的方式在操作臺上進行。使用Vivid7超聲儀檢查大鼠舒張末期左心室后壁厚度(LVPWD)、舒張末期室間隔厚度(IVSD)、左室舒張末期內徑(LVDd)、左室收縮末期內徑(LVDs)指標。

1.2.3病理學觀察 所有大鼠在禁食和禁水后，斷頭處死，立即提取大鼠心肌組織標本，使用40 ml/L的多聚甲醛進行固定，常溫下使用15%的乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣6 w，脫水后進行石蠟包埋，制作3 μm的組織切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察。

1.2.4細胞轉染 將四組大鼠心肌細胞，在培養瓶中進行培養融合，當細胞融合率在75%左右時，行胰酶消化，胰酶消化后終止消化(在新鮮的培養劑中)，使用細胞計數法測量終止消化后的細胞，測量出細胞密度后，將細胞種植于六孔板中，每個六孔板中大約種植4×105個細胞，加至新鮮的培養基中(3 ml)，之后進行孵育培養，在5%CO2、溫度為37℃的培養箱中孵育，細胞孵育到融合率在40%～80%時，取1.5 μl的質粒DNA溶于100 μl的雙抗培養基中(不含血清)，之后進行充分混合，混合均勻后進行離心處理至EP管底，在EP管中加入12 μl的PolyFect Reagent，進行上下重復顛倒，顛倒5次，進行混勻處理，在室溫環境下進行靜置，靜置時間5～10 min，對轉染復合物的形成起到促進作用，之后吸去置于六孔板中的培養基，將新鮮的完全培養基加入(3 ml)，在含有轉染復合體的EP管中加入含有血清和雙抗的600 μl完全培養基，行上下重復顛倒，顛倒2次，再次加入六孔板中，之后進行水平搖晃，以促進轉染復合物的均勻分布。之后進行培養，培養24 h后進行常規的換液處理，再次繼續24 h的培養，倒置，使用熒光顯微鏡下對熒光亮度進行觀察，對細胞進行收集，提取細胞RNA，鑒定轉染效率，將轉染效率最高的質粒組、空載組稀釋液接種于10 mm2培養皿中(PCR驗證篩選)，將40 μl嘌呤霉素加入每孔后常規培養，在對其培養3 d后將培養皿中的培養液棄去，選取經過PCR驗證篩選的細胞進行消化處理后稀釋，稀釋后接種在24孔板中，最終建立穩定轉染的ALDH2過表達組、ALDH2沉默組。

1.2.54-HNE水平檢測 采用酶聯免疫吸附試驗檢測各組4-HNE水平。

1.2.6心肌細胞凋亡、心肌梗死面積 采用流式細胞儀檢測，將各組細胞，轉染質粒24 h后，將細胞用不含EDTA的0.25%胰酶消化5 min至細胞瓶表面呈霧狀，磷酸鹽緩沖液(PBS)吹打下來，4℃ 2 000 r/min 3 min，PBS洗滌、離心、重懸2次，流式細胞儀分析細胞凋亡率。將大鼠心肌組織制作切片在1%的TTC溶液中，37℃孵化，每7～8 min翻動1次，染色15 min后使用生理鹽水清洗，使用氯化三苯基四氮唑法(TTC)法檢測大鼠心肌梗死面積。

1.2.7Western印跡檢測JNK、ERK、p53蛋白表達 將采集到的細胞，研磨后加入蛋白緩沖液，進行常規蛋白提取，采取蛋白質定量法(BCA)進行定量分析。50 μg的蛋白樣品上樣后十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，通過蛋白電轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，使用5%的脫脂奶粉TBST中進行避光封閉1 h，洗滌之后加入一抗稀釋溶液(JNK、ERK、p53按照1∶1 000比例進行稀釋)，在4℃的環境中過夜保存，洗滌后加入二抗稀釋溶液(JNK、ERK、p53按照1∶5 000比例進行稀釋)，在溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入電化學發光液，曝光2～3次，取重疊值。使用軟件分析蛋白條帶灰度值。內參蛋白是GAPDH。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件進行F檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1ALDH2抑制4-HNE對心肌梗死模型大鼠心功能的影響 與正常組相比，模型組、ALDH2過表達組、ALDH2沉默組LVDd、LVDs、LVPWD、IVSD水平升高，具有統計學差異(P<0.05)。與模型組相比，ALDH2過表達組、ALDH2沉默組LVDD、LVDS、LVPWD、IVSD水平顯著降低(P<0.05)；與ALDH2沉默組相比，ALDH2過表達組LVDd、LVDs、LVPWD、IVSD水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組心功能水平、4-HNE水平及肌細胞凋亡情況比較

2.2各組大鼠病理組織觀察 正常組心肌細胞細胞膜和細胞核保持完整，內質網正常，未見炎性細胞浸潤。模型組心肌細胞發生皺縮，內質網表現為空泡化，細胞內部結構完全消失，染色質連接成波浪狀。ALDH2沉默組內質網、線粒體腫脹，并且表現為空泡化；ALDH2過表達組心肌細胞結果得到顯著的改善。見圖1。

圖1 各組病理組織觀察(HE，×200)

2.3各組4-HNE水平比較 如表1所示，與正常組相比，模型組、ALDH2過表達組、ALDH2沉默組4-HNE水平升高，具有統計學差異(P<0.05)。與模型組相比，ALDH2過表達組、ALDH2沉默組4-HNE水平顯著降低(P<0.05)；與ALDH2沉默組相比，ALDH2過表達組4-HNE水平顯著降低(P<0.05)。

2.4ALDH2抑制4-HNE對心肌梗死模型大鼠心肌細胞凋亡、心肌梗死面積的影響 如表1所示，與正常組相比，模型組、ALDH2過表達組、ALDH2沉默組心肌細胞凋亡率、心肌梗死面積升高，具有統計學差異(P<0.05)。與模型組相比，ALDH2過表達組、ALDH2沉默組心肌細胞凋亡率、心肌梗死面積顯著降低(P<0.05)；與ALDH2沉默組相比，ALDH2過表達組心肌細胞凋亡率、心肌梗死面積顯著降低(P<0.05)。

2.5ALDH2抑制4-HNE對心肌梗死模型大鼠作用機制研究 如表2、圖2所示，與正常組相比，模型組、ALDH2過表達組、ALDH2沉默組JNK、ERK蛋白表達升高，p53蛋白表達顯著降低，具有統計學差異(P<0.05)。與模型組相比，ALDH2過表達組、ALDH2沉默組JNK、ERK蛋白表達顯著降低，p53蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與ALDH2沉默組相比，ALDH2過表達組JNK、ERK蛋白表達顯著降低，p53蛋白表達顯著升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠JNK、ERK、p53蛋白表達水平比較

圖2 Western印跡檢測JNK、ERK、p53蛋白表達

3 討 論

目前心肌梗死發病相關機制尚未明確，臨床中治療心肌梗死的方式主要包括抗凝、抗血小板、溶栓以及心肌再灌注等治療方式，雖然能夠降低患者心肌梗死的面積，但是對患者的心肌也產生不同程度的損傷，患者出現的并發癥較多，治療效果不理想〔7,8〕。因此尋找合適的治療手段對患者來說意義重大。

本研究結果說明ALDH2過表達能夠改善大鼠心功能相關指標水平，促進大鼠心功能恢復。本文通過病理學觀察，模型組大鼠心肌細胞發現有大量的炎性細胞浸潤，并且局灶性梗死瘢痕大面積出現，心肌纖維也發生斷裂，說明模型建立成功，與楊曉華等〔9〕研究結果保持一致。研究顯示，在心肌梗死發生后機體中產生的氧自由基，對生物膜磷脂不飽和脂肪酸脂質發生過氧化作用，導致復雜產物及新自由基產生〔10,11〕。脂質過氧化反應過程中主要產生的物質是醛基產物，會增加自由基的穩定性，促進氧自由基向細胞中擴散，對細胞產生損傷。江玲等〔12〕研究指出，4-HNE能夠對線粒體的活性產生破壞作用，造成線粒體發生線粒體功能障礙，導致細胞修復大分子損傷能力降低。因此抑制4-HNE水平，能夠減緩心肌損傷程度，對心肌梗死患者來說至關重要。4-HNE屬于一種較強的細胞毒素，能夠抑制心肌收縮力。在動物實驗研究中，4-HNE能夠誘導心律失常，在心肌缺血發生后，會造成機體產生組織損傷〔13〕。本研究結果說明ALDH2過表達抑制4-HNE水平顯著，降低心肌梗死后4-HNE產生，與Li等〔14〕研究結果一致。

ALDH2在4-HNE中發揮著酯酶和還原酶的作用，通過ALDH2能夠降低4-HNE毒性，從而減輕對心肌的損傷〔15〕。研究指出，將低乙醛及4-HNE水平，有助于提高機體的抗氧化能力，對動脈粥樣硬化的進程有緩解作用，從而降低心肌梗死的面積，避免心肌肥厚和收縮功能障礙產生〔16,17〕。本研究結果說明ALDH2過表達能夠減少心肌細胞凋亡及減少心肌梗死面積。p53是一種凋亡誘導蛋白，在4-HNE誘導心肌細胞凋亡過程中發揮著重要作用。ERK和JNK屬于重要的絲裂原活化蛋白激酶，在細胞活動中發揮著重要作用，通過活化ERK和JNK能夠將p53激活，對p53蛋白表達起到上調作用〔18,19〕。本文結果說明ALDH2過表達能夠下調JNK、ERK蛋白表達，上調p53蛋白表達。Yang等〔20〕研究也顯示，采用4-HNE刺激大鼠心肌細胞發現，JNK、ERK活化，表達升高，本研究與其研究一致。

綜上所述，過表達ALDH2能夠抑制4-HNE水平，改善心肌梗死大鼠心功能狀況，通過調控JNK、ERK、p53相關蛋白，能夠抑制心肌細胞凋亡,為其臨床治療提供新的治療思路。