不同孕周母親及其新生兒血氨基酸代謝譜變化特點

鐘凱苑 楊秋萍 郭微 李菲 石聰聰 李思濤 肖昕 李思平

1佛山市三水區婦幼保健院產科，廣東 528100；2中山大學附屬第六醫院兒科，廣州 510000；3佛山市三水區婦幼保健院兒科，廣東 528100

婦女妊娠期間，在身體結構、生理和生物化學等方面會發生復雜的改變，孕婦在妊娠期身體成分及代謝的改變將影響胎兒的生長發育，并影響妊娠結局。受孕產物、子宮和母體的血液中，蛋白質的含量比脂肪、碳水化合物的含量更為豐富［1］。足月時，胎兒及胎盤的總重量約4 kg，其中包含約500 g的蛋白質，占妊娠造成蛋白質增加的一半［2］。由此可見，妊娠期蛋白質代謝至關重要。本研究基于MS/MS的代謝組平臺，對不同孕周母親及其新生兒血氨基酸進行檢測分析，探討不同孕周母親及新生兒氨基酸代謝特點，為孕期營養補充提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取佛山市三水區婦幼保健院和中山大學附屬第六醫院產科、新生兒科2017年11月至2020年7月住院的健康妊娠婦女143例（年齡范圍21～35歲）及其所生新生兒143例（胎齡范圍28～41周），分為3組：＜32周，22例；32～36+6周，59例；≥37周，62例。所有孕婦無妊娠期合并癥或遺傳性高血脂、糖尿病、甲減、肝臟病或腎臟病病史。3組產婦一般臨床資料比較差異均無統計學意義，具有可比性。本研究獲得佛山市三水區婦幼保健院醫學倫理委員會、中山大學附屬第六醫院醫學倫理委員會的批準，所有血液樣本獲得孕婦的知情同意。

1.2 樣本收集 在孕婦及家屬了解和簽署遺傳代謝病疾病篩查知情同意書后，對孕婦及其所生新生兒進行血標本采集。干血片采集：在孕婦生產前、新生兒生后1 d內進行采血，對采血指尖/足跟進行消毒，使用采血針進行采血，血滴自然滲透濾紙，連續采集3個血斑，每個血斑直徑大于8 mm，且濾紙正反面完全充分滲透，以保證血濃度均勻一致且無滲血環。樣本存放及檢測：采血完畢后把血片平放在陰涼清潔地方進行自然晾干，同時避開紫外線、陽光照射及外源污染，干燥后的血片經檢查合格后置于密封袋內，于2～8℃冰箱中保存，于1周內在中山大學附屬第六醫院遺傳代謝病實驗室進行檢測。

1.3 檢測方法 血串聯質譜檢測儀器為Waters超效液相色譜（I-class）串聯質譜儀（Xevo-TQD，美國生物應用系統公司），采用琥珀酰丙酮和多種氨基酸、肉堿測定試劑盒進行非衍生化，干濾紙血片經打孔后加入含100μl內標的萃取液（甲醇∶超純水=8∶2），放入微孔板震蕩器以700轉/min、45℃條件下振蕩45 min后，室溫靜置5 min，取上清液75μl放于96孔耐熱V底板中，鋁膜覆蓋后上機檢測。

1.4 數據采集與分析 根據質譜峰的m/z進行定性，采用定量分析軟件自動計算出所測樣品氨基酸代謝產物的濃度值，利用SIMCA 14.0數據處理軟件，采用正交偏最小二乘判別分析法（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）對孕婦血氨基酸代謝物質進行分析并尋找關鍵差異代謝物。評價OPLS-DA模型匹配度的3個關鍵指標（R2X表示X矩陣解釋率；R2Y代表Y矩陣解釋率，二者共同反應模型穩定性；Q2代表模型預測性，3者都大于0.5表明模型匹配良好，越接近1說明模型的匹配度越高）。根據OPLS-DA模型所有變量S-plot圖越偏向兩端的物質，其協方差和相關性越大，以此篩選差異代謝物。P＜0.05為差異有統計學意義。

1.5 差異物質篩選標準 根據模型所得的變量權重圖（variable importance plot，VIP）尋找差異代謝物，選取VIP＞1的代謝物。

2 結 果

2.1 不同孕周母親及新生兒血氨基酸代謝譜分析結果 為了消除非必要因素作用的影響，完成兩組間最大化分離，尋找權重較大的差異代謝物，利用有監督OPLS-DA的方法去除與樣品分組無關的信息，分析不同孕周母親及新生兒血氨基酸代謝全譜。

2.1.1 不同孕周母親血氨基酸代謝譜分析結果 圖1為不同孕周母親血氨基酸代謝全譜數據的OPLS-DA得分圖。由圖1可看出，早產組與足月組母親血氨基酸水平分布在兩個區域，表明早產組與足月組母親血氨基酸水平差異有統計學意義。而早產兩組母親（＜32周與32～36+6周）血氨基酸分布在同一個區域，表明不同孕周的早產組母親血氨基酸水平差異無統計學意義。

圖1 不同孕周母親血氨基酸水平OPLS-DA聚類圖

2.1.2 不同胎齡新生兒血氨基酸代謝譜分析結果 圖2為不同胎齡新生兒血氨基酸代謝全譜數據的OPLS-DA得分圖。由圖2可看出，早產組與足月組新生兒血氨基酸水平分布在兩個區域，表明早產組與足月組新生兒血氨基酸水平差異有統計學意義。而早產兩組新生兒（＜32周與32～36+6周）血氨基酸分布在同一個區域，表明不同胎齡的早產新生兒血氨基酸水平差異無統計學意義。

圖2 不同胎齡新生兒血氨基酸水平OPLS-DA聚類圖

2.2 不同孕周母親及新生兒血氨基酸差異物質分析變量重要性得分圖是使用OPLS-DA模型進行有監督性分析方法中評價變量貢獻最常用的方法，根據VIP大于1.0對差異有統計學意義的物質進行篩選。本研究不同孕周母親及新生兒血氨基酸23個物質，經OPLS-DA模型分析后，不同孕周母親獲得丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸共6種權重大于1的差異代謝物（圖3）；不同胎齡新生兒獲得脯氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、組氨酸共5種權重大于1的差異代謝物（圖4）。

圖3 不同孕周母親血氨基酸權重圖（權重大于1）

圖4 不同胎齡新生兒血氨基酸權重圖（權重大于1）

2.3 不同孕周母親及新生兒血氨基酸差異物質水平對不同孕周母親及新生兒進行代謝組學分析，分別得到6個、5個差異代謝物，這些氨基酸水平數值見表1、2。由表中數據可看出，與孕周不足月的母親相比，孕周足月母親的丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸水平升高；新生兒組有5個權重較大的物質，與早產新生兒相比，足月新生兒谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸水平升高，而脯氨酸、組氨酸水平降低。

表1 不同孕周母親血氨基酸差異物質水平（μmol/L，±s）

表1 不同孕周母親血氨基酸差異物質水平（μmol/L，±s）

組別＜32周32～36+6周≥37周F值P值例數22 59 62丙氨酸139.12±20.00 137.59±27.72 244.67±84.83 56.86＜0.001甘氨酸129.52±35.00 117.59±24.81 165.76±61.67 17.45＜0.001谷氨酸193.51±25.52 188.05±40.25 238.40±73.79 13.43＜0.001脯氨酸99.94±18.92 104.69±20.83 137.41±41.31 20.98＜0.001纈氨酸83.60±12.96 84.76±13.11 112.17±25.63 35.29＜0.001亮氨酸93.82±20.06 94.65±18.28 112.62±35.94 7.64 0.001

3 討 論

近年來，串聯質譜技術發展迅速，有靈敏度高、特異性高和檢測快速的優點［3-4］。國內外有多篇研究應用該技術對尿液、血液、羊水和細胞等樣本中的氨基酸、有機酸、脂肪酸和類固醇激素等代謝物進行檢測［5-6］，能更早期、精準地識別和預測某些疾病，對減少疾病嚴重程度和并發癥的發生至關重要。因此，本研究基于MS/MS的代謝組平臺，對不同孕周的母親及其新生兒血氨基酸進行分析，研究血氨基酸水平的差異，幫助評估在不同孕周母親及新生兒血氨基酸代謝的狀態，為進一步的營養補充提供參考。

表2 不同胎齡新生兒血氨基酸差異物質水平（μmol/L，±s）

表2 不同胎齡新生兒血氨基酸差異物質水平（μmol/L，±s）

組別＜32周32～36+6周≥37周F值P值例數22 59 62脯氨酸431.63±235.66 571.62±228.19 190.83±117.11 61.88＜0.001谷氨酸151.40±34.43 177.98±44.23 319.06±104.78 67.89＜0.001甘氨酸144.84±48.13 172.51±44.88 277.98±129.10 27.27＜0.001丙氨酸184.11±54.80 201.22±50.75 307.47±127.38 25.42＜0.001組氨酸150.78±103.77 143.15±90.69 34.00±15.87 42.42＜0.001

本研究發現，在母親方面，孕周足月母親的丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸水平高于孕周不足月母親；在新生兒方面，足月新生兒的谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸水平高于早產新生兒，脯氨酸、組氨酸水平低于早產新生兒。然而不論是母親還是新生兒，孕32周前與32～36+6周的血氨基酸水平比較差異有統計學意義，這提示早產與足月的母親/新生兒的氨基酸代謝差異有統計學意義，主要集中體現在上述7種氨基酸。

丙氨酸是一種生糖氨基酸，在人體內最經典的代謝途徑為丙氨酸-葡萄糖循環，在肝臟丙氨酸能夠迅速轉化葡萄糖為機體供能［7］，足月時母親及新生兒的丙氨酸水平升高，提示足月時胎兒發育對葡萄糖的需求更大，需要更高的丙氨酸進行糖異生提供能量。

甘氨酸是結構最簡單的一種人體非必需氨基酸，研究認為甘氨酸可用于血紅素、蛋白質、核酸的生物合成［8］，還能夠調節細胞因子、超氧化物的產生和免疫功能［9］，另外甘氨酸還是抑制性神經遞質［10］，因此甘氨酸在生物合成、抗氧化反應、神經調節等方面具有重要作用，足月時母親及新生兒的甘氨酸水平均升高，提示可能足月時胎兒進行大量的蛋白合成、體內代謝活躍、存在氧化應激，需要更多的甘氨酸。

谷氨酸是一種酸性氨基酸，是中樞神經系統含量最多的氨基酸，參與誘導突觸形態及功能的變化、影響自主運動神經系統。谷氨酸不能透過血腦屏障，飲食中的谷氨酸主要為腸細胞代謝，為腸上皮細胞的主要能源物質［11］。有研究者提出胎盤和胎兒肝臟之間的Glu-Gln循環假說，谷氨酸和谷氨酰胺是胎盤和胎兒肝臟能量的主要來源，可以為嘌呤合成提供氮源［12］。研究發現，宮內生長遲緩的母體谷氨酸濃度顯著降低［13］。本研究中足月母親及新生兒的谷氨酸水平均升高，提示谷氨酸對胎兒體質量、神經發育、代謝具有重要意義。

脯氨酸是一種環狀的亞氨基酸，在蛋白合成、抗氧化、機體新陳代謝等方面具有重要調控作用，研究發現適量添加脯氨酸可以促進胚胎、胎盤、孕體的生長發育［14］。組氨酸被稱為半必需氨基酸，由于僅依靠體內合成而不從食物攝取則無法滿足機體生長需要，因此組氨酸對嬰幼兒的生長發育也至關重要。本研究中，脯氨酸水平在足月母親體內水平升高，而在足月新生兒體內水平降低，表明孕足月時胎兒生長發育迅速，對脯氨酸需求高，足月新生兒由于其自身大量消耗，而此時攝入相對不足，使得體內脯氨酸及組氨酸水平降低。

對比母嬰上述幾種差異權重較大的氨基酸水平，發現脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸在新生兒中的水平均高于孕母，尤其是脯氨酸；而新生兒谷氨酸水平低于孕母。這提示胎兒在整個發育過程中，需要大量氨基酸的供給以完成蛋白合成、新陳代謝、自身生長發育，因此在母嬰之間多種氨基酸呈現主動轉運過程。而谷氨酸雖然是神經系統發育的重要氨基酸，但有研究提示過高的谷氨酸會導致神經毒性，其水平是判斷缺氧缺血性腦病病情嚴重程度及預后的客觀指標［15-16］，因此新生兒谷氨酸水平低于孕母。

在漫長的妊娠周期，孕婦各個器官都由于妊娠而產生巨大變化，但目前尚未有研究探討妊娠期婦女及其新生兒的代謝情況，本研究對不同孕周母親及其新生兒血氨基酸水平進行檢測，發現早產與足月的母親/新生兒的氨基酸代謝有明顯差異，可初步評估母嬰血氨基酸代謝情況，為妊娠期營養或新生兒期營養提供參考，助力于孕體及胎兒的健康生長發育。孕母與新生兒血氨基酸的轉運通路及機制尚不明確，有待更深入的分子研究。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。