Box-behnken響應面法優化紫紅生肌軟膏的醇提工藝

劉淑蘭 周藝林 林鵬 龔衛平 歐陽銳 夏新華

〔摘要〕 目的 優選紫紅生肌軟膏的醇提工藝參數，為紫紅生肌軟膏的新藥開發提供依據。方法 以梔子苷、連翹酯苷A、羥基紅花黃色素A為評價指標，在單因素試驗的基礎上，以乙醇濃度、加醇量、提取時間為考察因素，采用Box-behnken響應面法設計試驗，采用層次分析法-熵權法組合賦權確定各指標權重系數并計算綜合評分，從而優化紫紅生肌軟膏醇提工藝參數。結果 紫紅生肌軟膏最佳醇提工藝為采用70%的乙醇為溶劑提取兩次，第1次加9倍量乙醇提取150 min，第2次加7倍量乙醇提取120 min。該工藝參數綜合評分的模型實測值為100.70，與模型預測值接近。結論 優選出的紫紅生肌軟膏最佳醇提工藝穩定可行，可為紫紅生肌軟膏進一步開發為新藥提供依據。

〔關鍵詞〕 紫紅生肌軟膏;Box-behnken響應面;醇提工藝;層次分析法;熵權法;梔子苷;連翹酯苷A;羥基紅花黃色素A

〔中圖分類號〕R283? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.04.007

〔Abstract〕 Objective To optimize the alcohol-extraction process parameters of Zihong Shengji Ointment and provide the basis for the new drug development of Zihong Shengji Ointment. Methods The geniposide， forsythiaside A， hydroxysafflor yellow A were used as evaluation indexes. On the basis of single factor experiment， the ethanol concentration， the amount of alcohol added and extraction time were used as investigation factors， the experiments were designed by Box-behnken response surface， and the weight coefficients of each index were determined by analytic hierarchy process-information entropy weight method， and the comprehensive score was calculated， so as to optimize the alcohol-extraction process parameters of Zihong Shengji Ointment. Results The optimum alcohol-extraction process of Zihong Shengji Ointment was 70% ethanol for two times， the first time was added with 9 times ethanol for 150 min， and the second time was added with 7 times ethanol for 120 min. The measured value of the comprehensive score of the process parameters was 100.70， which was close to the predicted value. Conclusion The optimized alcohol-extraction process of Zihong Shengji Ointment is stable and feasible， which can provide basis for the further development of Zihong Shengji Ointment as new drugs.

〔Keywords〕 Zihong Shengji Ointment; Box-behnken response surface; ethanol-extraction process; analytic hierarchy process; information entropy; geniposide; forsythiaside A; hydroxysafflor yellow A

糖尿病是一種慢性疾病，在世界范圍內發病率呈逐年增長趨勢。糖尿病足是由于糖尿病異常代謝引起下肢神經功能障礙、外周血管結構異常，進而導致足部變形、潰瘍形成和肢端壞疽[1-3]。紫紅生肌軟膏是多年臨床實踐的經驗方，由梔子、連翹、紅花等6味中藥組成，具有抗炎活血、化腐生肌的功效，臨床用于治療濕熱下注型糖尿病足潰瘍具有確切療效[3]。梔子為方中君藥，具有清熱利濕作用，其活性成分梔子苷具有抗凋亡、抗炎和抗動脈粥樣硬化作用[4];連翹為方中臣藥，具有抗炎、抗菌、抗氧化、清熱解毒、消腫散結的作用，也有研究[5]表明連翹酯苷A通過介導Nrf2和內質網應激通路的激活，對局灶性腦缺血損傷具有保護作用;紅花為佐藥，其中黃酮類化合物羥基紅花黃色素A是血小板活化因子受體拮抗劑，具有散瘀止痛、促進血液循環的作用[6]，還可促進血管生成、減輕炎癥反應，促進糖尿病創面愈合，臨床上可用于治療炎癥相關疾病[6-7]。預試驗發現，方中藥物采用乙醇提取比水提取更利于有效成分的浸出，且醇提濃縮液直接作為水相可比藥物細粉加入水相制備出的軟膏更細膩、分散更均勻，局部應用于糖尿病足，可發揮消炎鎮痛、促進創面愈合等作用。為進一步確定該制劑合理的生產工藝，保證其臨床療效，本試驗以梔子苷、連翹酯苷A和羥基紅花黃色素A的轉移率及浸膏得率為指標綜合評分，采用層次分析法-熵權法[8-10]確定權重系數，結合Box-behnken響應面[11-13]對提取工藝進行優選，篩選該處方的最佳提取工藝參數，為該制劑的中試放大及工業化生產提供實驗依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）;YP10002型電子天平（上海越平科學儀器有限公司）;XB220A型分析天平（廣州市博勒泰貿易有限公司）;RZ-2000B型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

藥材飲片均購于康美藥業股份有限公司，經湖南中醫藥大學劉塔斯教授鑒定，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）要求。梔子苷對照品（批號：110749-201919，質量分數97.1%，中國食品藥品檢定研究院）、連翹酯苷A對照品（批號：111810-201707，質量分數97.2%，中國食品藥品檢定研究院）、羥基紅花黃色素A對照品（批號：111637-201810，質量分數93.1%，中國食品藥品檢定研究院），乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1? 梔子苷、羥基紅花黃色素A含量測定

2.1.1? 色譜條件? 色譜柱：Thermo scientific C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（12∶88）;檢測波長：238 nm（梔子苷）、403 nm（羥基紅花黃色素A）;柱溫：30 ℃;流速：1 mL/min;進樣量：5 μL。

2.1.2? 對照品溶液的制備? 精密稱取梔子苷對照品、羥基紅花黃色素A對照品適量，加甲醇制成梔子苷95.55 μg/mL、羥基紅花黃色素A 24.39 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3? 紫紅生肌軟膏醇提液及供試品溶液的制備? 稱取處方中梔子、連翹、紅花等藥材飲片110 g，加70%乙醇提取兩次，第1次加8倍量乙醇提取120 min，第2次加6倍量乙醇提取90 min，濾過，合并濾液，濃縮，定容至250 mL，備用。

從醇提液中精密吸取1 mL，加甲醇定容至20 mL，吸取1 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.1.4? 缺梔子陰性、缺紅花陰性對照溶液的制備? 分別稱取處方中除梔子外各味藥材、除紅花外各味藥材，按“2.1.3”項下方法制備，即得。

2.1.5? 專屬性試驗? 精密吸取上述混合對照品溶液、供試品溶液、缺梔子陰性對照溶液、缺紅花陰性對照溶液各5 μL，按“2.1.1”項下色譜條件測定，結果表明，供試品色譜中梔子苷與羥基紅花黃色素A色譜分離良好，且缺梔子、紅花的陰性對照均未見干擾（見圖1）。

2.1.6? 線性關系考察? 精密稱取梔子苷對照品、羥基紅花黃色素A對照品適量，加甲醇制成濃度分別為191.11 μg/mL、39.03 μg/mL的混合對照品母液。精密吸取上述混合對照品母液1、2、4、6、8、10 mL，甲醇定容至10 mL，得梔子苷濃度分別為19.11、38.22、76.44、114.66、152.88、191.11 μg/mL，羥基紅花黃色素A濃度分別為3.90、7.81、15.61、23.42、31.22、39.03 μg/mL的混合對照品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件測定，以梔子苷或羥基紅花黃色素A進樣量為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），分別進行線性回歸，得梔子苷回歸方程為Y=1.230 9X+ 1.789，R2=0.999 1，線性范圍為95.55～955.55 ng、羥基紅花黃色素A回歸方程為Y=2.570 1X-5.795 1，R2=0.999 5，線性范圍為19.50～195.15 ng。

2.1.7? 方法學考察? 根據“2.1.1”項下色譜條件，測得梔子苷精密度RSD為1.58%，重復性RSD為0.33%，穩定性RSD為0.28%，平均加樣回收率為103.48%，加樣回收率RSD為1.46%;羥基紅花黃色素A精密度RSD為1.43%，重復性RSD為0.67%，穩定性RSD為0.90%，平均加樣回收率為101.06%，加樣回收率RSD為1.59%，表明該方法可用于梔子苷和羥基紅花黃色素A的含量測定。

2.2? 連翹酯苷A含量測定

2.2.1? 色譜條件? 色譜柱：Thermo scientific C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：乙腈-0.4%冰醋酸溶液（15∶85）;檢測波長：330 nm;柱溫：25 ℃;流速：1 mL/min;進樣量：5 μL。

2.2.2? 對照品溶液的制備? 精密稱取連翹酯苷A對照品適量，加甲醇制成141.912 μg/mL的連翹酯苷A對照品溶液。

2.2.3? 供試品溶液的制備? 精密吸取“2.1.3”項下的醇提液1 mL，甲醇定容至10 mL，吸取1 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4? 缺連翹陰性對照溶液的制備? 稱取處方中除連翹外各味藥材，按“2.1.3”項下方法制備，即得。

2.2.5? 專屬性考察? 精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液、缺連翹陰性對照溶液各5 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定。結果表明供試品色譜中連翹酯苷A色譜峰分離良好，且缺連翹的陰性對照未見干擾。見圖2。

2.2.6? 線性關系考察? 精密稱取連翹酯苷A對照品溶液適量，加甲醇制成濃度為141.912 μg/mL的對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，甲醇定容至10 mL，制成濃度分別為14.191、28.382、56.764、85.146、113.528、141.912 μg/mL的連翹酯苷A對照品溶液。按“2.2.1”項下色譜條件測定，以連翹酯苷A進樣量為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸，得連翹酯苷A回歸方程為Y=1.597X+6.654 8，R2=0.999 1，線性范圍為70.96～709.56 ng。

2.2.7? 方法學考察? 根據“2.2.1”項下色譜條件，測得連翹酯苷A精密度RSD為0.72%，重復性RSD為0.98%，穩定性RSD為0.66%，平均加樣回收率為103.19%，加樣回收率RSD為0.98%，表明該方法可用于連翹酯苷A的含量測定。

2.3? 浸膏得率的測定

精密吸取“2.1.3”項下醇提液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃真空干燥 3 h，置干燥器中冷卻 0.5 h，迅速稱重，計算浸膏得率Y4[11]。

2.4? 單因素考察

2.4.1? 乙醇濃度考察? 稱取處方中梔子、連翹、紅花等飲片110 g，固定提取次數為2次，第1次加8倍量乙醇提取90 min，第2次加6倍量乙醇提取60 min，考察不同乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）對各項指標的影響（見圖3）。由圖3可知，當乙醇濃度增加到70%時，各項指標值呈下降趨勢，因此選取乙醇濃度為50%～70%作為考察范圍。

2.4.2? 加醇倍量考察? 稱取處方中梔子、連翹、紅花等飲片110 g，固定提取次數為2次，乙醇濃度為70%，提取時間為第1次90 min、第2次60 min，考察不同加醇量（第1次分別為6、8、10、12倍，第2次分別為4、6、8、10倍）對各項指標的影響（見圖4）。由圖4可知，隨著加醇倍量增加，各項指標值變化不明顯或略有增加，結合經濟角度考慮，選取加醇倍量為10～18倍作為考察范圍。

2.4.3? 提取時間考察? 稱取處方中梔子、連翹、紅花等飲片110 g，固定提取次數為2次、乙醇濃度為70%，加醇量為第1次8倍量，第2次6倍量，考察不同提取時間（第1次分別為60 min、90 min、120 min、150 min;第2次分別為30 min、60 min、90 min、120 min）對各項指標的影響（見圖5）。由圖5可知，隨著提取時間的增加，梔子苷、羥基紅花黃色素A轉移率先增加后基本保持平穩，連翹酯苷A提取210 min時轉移率達最大值，浸膏得率變化不明顯，故選取提取時間為150～270 min作為考察范圍。

2.5? Box-Behnken響應面法優化紫紅生肌軟膏的醇提工藝

2.5.1? Box-Behnken響應面試驗設計? 在單因素試驗基礎上，選擇乙醇濃度（A）、加醇倍量（B）和提取時間（C）作為考察因素，提取次數為2次，采用Box-Behnken響應面法進行試驗設計，試驗因素與水平見表1。稱取處方中梔子、連翹、紅花等飲片110 g，共17份，分別按相應條件提取，收集提取液，測定各項指標值。

2.5.2? 指標權重的確定

2.5.2.1? 層次分析法（analytic hierarchy process， AHP）確定權重? AHP是指將與決策總是有關的元素分解成目標、準則、方案等層次，在此基礎之上進行定性和定量分析的決策方法[14-15]。在本試驗中，將綜合評分設為決策目標，將梔子苷、連翹酯苷A、羥基紅花黃色素A的轉移率及浸膏得率設為方案層，根據紫紅生肌處方的君臣佐使、配伍規律、各成分藥效作用強弱，將4種指標成分作為權重指標予以量化。梔子苷記為1;為處方君藥梔子的有效成分，連翹酯苷A記為2;紅花有效成分羥基紅花黃色素A，記為3;浸膏得率非常重要，記為4。各指標的優先順序為：梔子苷轉移率>連翹酯苷A轉移率>羥基紅花黃色素A轉移率>浸膏得率。指標成對比較的判斷優先矩陣見表2。

根據測定結果，用spssau計算得到梔子苷轉移率、連翹酯苷A轉移率、羥基紅花黃色素A轉移率、浸膏得率4項指標權重系數分別為0.465 8、0.277 1、0.161 1、0.096 0，根據公式CR=CI/RI（CR：隨機一致性比率，CI：一致性指標，RI：平均隨機一致性指標），CR=0.012<0.10，即指標優先比較判斷矩陣具有良好的一致性，權重系數有效。

2.5.2.2? 信息熵權法確定權重? 信息熵權法是一種根據各指標原始數據所提供信息量的大小來確定各指標權重的客觀賦權法。該指標的原始數據差異越大，其熵值越小，提供的信息量就越大，其在綜合評價中所起的作用也越大，即所占權重就越大，反之，其所占權重就越小[11-13]。

根據測定結果，采用EvaGear 2.1.7486軟件分別計算梔子苷轉移率、連翹酯苷A轉移率、羥基紅花黃色素A轉移率、浸膏得率4個評價指標的權重系數為0.212 7、0.423 4、0.152 9、0.211 0。

2.5.2.3? AHP-熵權法組合權重? 根據紫紅生肌軟膏功能主治及復方的君臣佐使分析，AHP法量化了評價指標兩兩比較判斷的優先信息，得到了以主觀信息為基礎的權重系數，基本體現了紫紅生肌軟膏各指標的主次順序及復方君臣佐使的順序;同時采用熵權法求得相應指標的客觀權重系數，不僅考慮到了各樣本數據的變異性及指標間的相關性對賦權的影響，也避免了主觀賦權存在的偏頗，故而將二者結合起來，根據公式W組合ij=WAHPij

W熵權法ij∑WAHPijW熵權法ij計算組合權重，以期得到更加客觀、真實的評價結果。按上述公式計算得到梔子苷轉移率、連翹酯苷A轉移率、羥基紅花黃色素A轉移率、浸膏得率4項指標組合權重系數分別為0.379 2、0.449 0、0.094 3、0.077 5。

2.5.3? 響應面試驗結果與分析? 根據各項指標測定值和“2.5.2.3”確定的權重系數，按公式計算：

綜合評分=（Y1/Y1max×0.397 2+Y2/Y2max×0.449 0+Y3/Y3max×0.094 3+Y4/Y4max×0.077 5）×100%

應用Design Expert 8.0.6.1軟件，將表3中綜合評分與乙醇濃度、加醇倍量、提取時間進行響應面回歸分析，得到二次回歸方程為Y=97.26+2.92A+4.08B+3.00C+1.64AB+3.07AC+1.79BC-3.35A2-5.17B2-4.85C2，R2=0.985 7，對模型進行方差分析，結果見表4。由表4可知，以綜合評分為響應值時，該二次方程模型極顯著（F=53.75，P<0.000 1），回歸方程失擬項無統計學意義（P=0.088 0），表明未知因素對實驗結果干擾很小。模型中因素A、B、C、AC、A2、B2、C2有極顯著影響（P<0.01），因素AB、BC有顯著影響（P<0.05）。根據F值可知，各因素對綜合評分影響的大小順序為B（加醇倍量）>C（提取時間）>A（乙醇濃度）。利用模型優化出的最佳方案為采用70%乙醇為溶劑提取2次，第1次加9倍量乙醇提取150 min，第2次加7倍量乙醇提取120 min，綜合評分為101.05。

響應面分析見圖6。由圖6可知，因素AB、BC、AC響應曲面均稍陡峭，且AB、BC、AC等高線呈橢圓，表明其交互作用均較強[13-14];當固定加醇量為16（9、7）倍時，綜合評分隨著乙醇濃度的增加而升高，到達臨界值后減小，且隨著乙醇濃度變化稍明顯，表明兩者交互作用較強;當固定提取時間為270（150、120） min時，綜合評分隨著乙醇濃度增加而顯著升高，到達臨界值后減小，且隨著乙醇濃度變化明顯，表明兩者交互作用強;當固定乙醇濃度為70%時，綜合評分隨著提取時間增加而升高，隨后減小，且隨著乙醇濃度變化稍明顯，表明兩者交互作用較強;各因素交互作用強弱依次為AC>BC>AB，與方差分析結果一致。

2.5.4? 醇提工藝最佳參數選擇與驗證? 選取響應面最高點對應水平為最佳工藝參數，即乙醇濃度70%、第1次加9倍量乙醇提取150 min，第2次加7倍量乙醇提取120 min。稱取醇提處方量飲片3份，按上述最佳工藝條件進行3次平行試驗驗證。結果見表5。由表5可知，3次驗證試驗平均綜合評分為100.70，RSD為0.45%，與模型預測值（101.05）接近，說明該醇提工藝的準確性與穩定性良好。

3 討論

中藥復方成分復雜，采用單一指標評價復方的內在質量具有極大的片面性，因此，本試驗選擇方中多個活性成分的轉移率和浸膏得率作為提取工藝的評價指標，符合中藥復方多成分多靶點起效的特點。

本試驗比較了不同流動相（乙腈-水、乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.1%磷酸）體系下羥基紅花黃色素A與梔子苷的分離情況，結果表明乙腈-0.1%磷酸作為流動相時羥基紅花黃色素A與梔子苷分離效果好。采用DAD檢測器對羥基紅花黃色素A與梔子苷進行全波長掃描，根據兩者最大吸收波長及吸收曲線，選擇403 nm波長處測定羥基紅花黃色素A含量、238 nm波長處測定梔子苷含量。雙波長同時檢測羥基紅花黃色素A與梔子苷，具有操作簡便快捷，準確可靠、靈敏度高的特點。

結合文獻與預試驗結果，固定提取次數為2次，通過單因素試驗考察了不同乙醇濃度、不同加醇倍量、不同提取時間對各指標成分的影響，實驗結果表明上述3個因素對浸膏得率無明顯影響，確定乙醇濃度考察范圍為50%～70%，加醇倍量為10～18倍，提取時間為150～270 min。通過單因素試驗能合理地安排實驗點，減少實驗次數，為后續響應面設計提供依據。

Box-Behnken響應面設計是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法，可以建立連續變量曲面模型，對影響因子及其交互作用進行評價，確定最佳水平范圍。本試驗采用層次分析法與熵權法組合賦權計算綜合評分，作為Box-Behnken響應面試驗的響應值，既能夠將轉移率等指標的重要性轉化為可量化的權重系數，又能夠通過熵權法體現樣本客觀數據信息，消除人為設定量化指標的主觀性。采用Box-Behnken響應面設計篩選出的最佳工藝為采用70%乙醇為溶劑提取2次，第1次加9倍量乙醇提取150 min，第2次加7倍量乙醇提取120 min。優化后的提取工藝結果穩定可靠，可為該處方的工業化生產及進一步開發提供重要依據，同時也可為今后中藥提取工藝響應面試驗設計的因素選擇提供參考。

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（本文編輯? 蘇? 維）