熒光PCR熔解曲線法在非結核分枝桿菌菌種鑒定中的應用價值

李愛芳 談小文 崔曉利 康磊 黨麗云 張耀輝 楊翰

非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)是指除結核分枝桿菌復合群及麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌總稱[1]。NTM感染常可引起肺部疾病，且NTM肺病的臨床癥狀有與結核病相似的全身中毒癥狀和局部損傷表現，因而容易造成誤診而耽誤治療。由于大部分NTM對常用抗結核藥物普遍具有耐藥性，且不同NTM對藥物的敏感性也不相同，NTM肺病患者在全世界范圍內呈上升趨勢，已成為威脅人類健康的重要公共衛生問題[2-3]。因此，臨床上對分枝桿菌的快速鑒定意義重大。

隨著實驗室檢測技術的不斷進步，越來越多的分子生物學方法應用于分枝桿菌快速鑒定，如DNA探針雜交、DNA測序、基因芯片技術等[4-7]。目前，國內實驗室主要采用傳統的細菌學分類方法進行菌種鑒定，但這種方法操作繁雜、費時，不適用于臨床快速診斷。近年來，基因芯片法因其多樣品、高通量等優點逐漸成為臨床最常用的菌種鑒定方法；而16S rRNA基因測序法鑒定NTM快速準確，是鑒定分枝桿菌比較權威的方法[8]。熒光PCR熔解曲線法是一種簡單、快速用于菌種鑒定的分子生物學方法，該方法根據不同分枝桿菌基因轉錄間隔區(intergenic transcribed spacer，ITS)片段的特異序列設計探針，采用特定的熒光通道和熔點進行分枝桿菌鑒別。熒光PCR熔解曲線法使用熒光PCR儀及配套軟件即可進行檢測和結果分析，與16S rRNA基因測序法相比，對儀器和實驗人員技術要求更低，價格也更便宜，適宜臨床常規開展。本研究采用熒光PCR熔解曲線法、基因芯片法及16S rRNA基因測序法進行分枝桿菌菌種鑒定，評價熒光PCR熔解曲線法的檢測效能。

材料和方法

一、 一般資料

收集西安市胸科醫院2020年4—10月經BACTEC MGIT 960液體培養陽性、MPB64快速抗原檢測陰性的疑似NTM臨床分離株，共71株(例)，每株(例)臨床分離株采用同一標本分別進行熒光PCR熔解曲線法、基因芯片法及16S rRNA基因測序法進行菌種鑒定。

二、 研究方法

1. 主要儀器與試劑：Lad-Aid 824s核酸提取儀、SLAN系列實時熒光定量PCR檢測系統、Lad-Aid 824結核分枝桿菌核酸提取Maxi試劑、分枝桿菌鑒定試劑盒(購自廈門致善生物科技有限公司)、芯片雜交儀、SlideWasherTM8 型芯片洗滌儀和微陣列芯片掃描儀(購自北京博奧生物科技有限公司)、晶芯?分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法，購自北京博奧生物科技有限公司)。

2. 核酸提取：培養后的菌液按照Lad-Aid 824結核分枝桿菌核酸提取Maxi試劑盒說明書提取核酸。模板保存于-20 ℃，避免反復凍融。

3. 熒光PCR熔解曲線法菌種鑒定：按試劑說明書進行操作。打開原裝的分枝桿菌PCR反應管管蓋并丟棄，用微量加樣槍向每支PCR薄壁反應管中加入25 μl 相應的提取樣本(模板)或陰性/陽性對照品，之后立即蓋嚴待用的透明PCR八連管管蓋。漩渦振蕩混勻20 s，瞬時離心數秒，除去氣泡。進行PCR擴增和熔解曲線分析。

4. 基因芯片法菌種鑒定：按試劑盒說明書進行操作，分裝試劑每管18 μl，分別加入2 μl 核酸樣本，漩渦振蕩混勻，瞬時離心數秒，進行PCR擴增。將PCR產物以95 ℃變性5 min，立即置于冰中淬火3 min 以上，得到單鏈核酸。雜交緩沖液通過50 ℃溫浴，以每管9 μl分裝至八連管中，加入6 μl單鏈核酸，混勻，加樣至芯片孔內。放入芯片雜交儀進行雜交、洗滌、甩干，然后進行掃描，結果判讀。

5. 16S rRNA基因測序法：將提取的核酸作為DNA模板，送上海生工生物工程有限公司進行16S rRNA 基因測序，將測序結果提交NCBI網站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性比較。依據鑒定菌種的DNA序列與參照菌種的同源性≥97%來確定菌種。

三、統計學處理

使用SPSS 19.0軟件對數據進行統計學分析。以16S rRNA基因測序法為參考標準，計算熒光PCR熔解曲線法菌種鑒定的敏感度、特異度及符合率，并進行一致性分析(Kappa檢驗)。Kappa值<0.2為一致性較差，0.2～0.4為一致性一般，0.41～0.60為一致性中等，0.61～0.80為基本一致，0.81～1.00為幾乎完全一致。

結 果

一、3種方法菌種鑒定結果分析

71株疑似NTM菌株經熒光PCR熔解曲線法、基因芯片法及16S rRNA基因測序法鑒定為結核分枝桿菌4株，NTM 67株，NTM具體分類見表1。

表1 不同非結核分枝桿菌通過3種方法鑒定的結果

二、熒光PCR熔解曲線法菌種鑒定臨床應用價值

以 16S rRNA基因測序法為標準，熒光PCR熔解曲線法檢測龜/膿腫分枝桿菌的敏感度、特異度和符合率分別為100.0%(24/24)、97.7%(42/43)和98.5%(66/67)，檢測胞內分枝桿菌的敏感度、特異度和符合率分別為94.4%(17/18)、100.0%(49/49)和98.5%(66/67)，檢測戈登分枝桿菌的敏感度、特異度和符合率分別為5/5、98.4%(61/62)和98.5%(66/67)，檢測堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、鳥分枝桿菌的敏感度、特異度和符合率均為100.0%，檢測河床(蜂房)分枝桿菌的敏感度、特異度和符合率分別為0(0/1)、100.0%(66/66)和98.5%(66/67)。見表2。

表2 以 16S rRNA基因測序法為標準評價熒光PCR熔解曲線法對非結核分枝桿菌菌種鑒定的價值

三、不一致結果分析

有11株NTM菌株3種方法檢測結果不一致。以16S rRNA基因測序法為標準，熒光PCR熔解曲線法鑒定結果與16S rRNA基因測序法結果有2株不同，1株將胞內分枝桿菌鑒定為龜/膿腫分枝桿菌，1株將河床(蜂房)分枝桿菌鑒定為戈登分枝桿菌，一致率達97.0%(65/67)；基因芯片法鑒定結果11株與16S rRNA基因測序法不同，1株將胞內分枝桿菌鑒定為鳥分枝桿菌，1株將胞內分枝桿菌鑒定為其他分枝桿菌，2株將瘰疬分枝桿菌鑒定為堪薩斯分枝桿菌，2株將戈登分枝桿菌鑒定為堪薩斯分枝桿菌，1株將河床(蜂房)分枝桿菌鑒定為恥垢分枝桿菌，1株將膿腫分枝桿菌鑒定為胞內分枝桿菌，1株將緩黃分枝桿菌鑒定為其他分枝桿菌，2株將其他分枝桿菌分別鑒定為鳥分枝桿菌和土分枝桿菌，一致率為83.6%(56/67)。

討 論

目前，NTM菌種類型約有190余種，其中約1/3與人類疾病有關[9]。目前，NTM肺病在全世界范圍內都有明顯上升的趨勢[10-12]。NTM與結核分枝桿菌形態相似，人類感染后臨床癥狀、病理改變等都很相似，臨床上難以區分，易造成誤診[13]。且由于NTM對大部分抗結核藥物耐藥，常常會延誤NTM肺病患者的治療而造成不良后果。因此，快速、準確的檢測并鑒定NTM，對于患者早期接受準確治療意義重大。

本研究結果發現，在檢出的NTM菌株中，龜/膿腫分枝桿菌和胞內分枝桿菌占比最高。這與劉東鑫等[14]關于廣州市NTM分離株鑒定結果較為一致。不足的是戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、鳥分枝桿菌、河床(蜂房)分枝桿菌、土分枝桿菌及恥垢分枝桿菌等檢出數量較低，但其占所有檢出NTM的比例與包訓迪等[15]、林建等[6]關于安徽省和福建省NTM分離株菌種分布結果較為一致，均占比較低。

本研究結果發現，對于臨床常見的多種NTM，如龜/膿腫分枝桿菌、胞內分枝桿菌、戈登分枝桿菌，熒光PCR熔解曲線法檢測具有較高的敏感度和特異度，均大于94%；對于臨床分離率較低的堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、鳥分枝桿菌檢測的敏感度、特異度和符合率均為100.0%，能夠滿足臨床快速準確檢測的需求。不足的是，熒光PCR熔解曲線法僅能識別19種分枝桿菌，對于臨床上較為罕見的NTM，以及試劑盒檢測范圍外的其他分枝桿菌檢測結果可能存在一定差異，需要采用16S rRNA基因測序法進行進一步鑒定。

本研究通過比較熒光PCR熔解曲線法、基因芯片法和16S rRNA基因測序法進行菌種鑒定的結果，發現熒光PCR熔解曲線法與16S rRNA基因測序法一致率較高，達97.0%，而實驗室目前常用的基因芯片法與16S rRNA基因測序法一致率為83.6%，熒光PCR熔解曲線法菌種鑒定的一致率高于基因芯片法。這可能與兩種方法的檢測原理和敏感度有一定關系。基因芯片法菌種鑒定是將序列已知的寡聚核苷酸探針分子固定于芯片基片，然后與待測標本中標記的核酸進行分子雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度，對17種臨床常見分枝桿菌進行快速鑒定[9]。熒光PCR熔解曲線法菌種鑒定根據不同分枝桿菌基因ITS片段的特異序列設計探針，采用特定的熒光通道和熔點進行分枝桿菌鑒別，可以檢測臨床和環境中常見的19 種分枝桿菌[16]。實際工作中我們還發現，基因芯片法菌種鑒定對樣本核酸濃度要求較高，核酸濃度太高時背景熒光信號過強，不利于結果判讀，核酸濃度太低時熒光信號過弱，易判讀為無分枝桿菌。

本研究所使用的分枝桿菌鑒定試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)適用于臨床和環境中常見的19種分枝桿菌的定性鑒定，包括結核分枝桿菌復合群、恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、龜分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌、海分枝桿菌或潰瘍分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產色分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、胞內分枝桿菌和鳥分枝桿菌。熒光PCR熔解曲線法進行菌種鑒定需要試劑配制、核酸提取、PCR擴增及熔解曲線分析3個步驟，而目前臨床上常用的基因芯片法菌種鑒定需要試劑配制、核酸提取、PCR擴增、芯片雜交及掃描分析4個步驟，比熒光PCR熔解曲線法多了芯片雜交及掃描分析這一步驟，而這一步驟至少耗時3 h；熒光PCR熔解曲線法相比于基因芯片法使用儀器更少，占用實驗室資源更少(基因芯片法芯片雜交需在分子生物學實驗室四區進行)，實驗成本更低；16S rRNA基因測序法雖然是基于核酸序列的鑒定方法中最直接可靠的方法，但由于其對技術和儀器要求較高，費用也更昂貴，不適用于臨床實驗室常規開展。因此，熒光PCR熔解曲線法菌種鑒定更加快速和便捷，應用范圍更廣，尤其對于基層實驗室條件較差、人員不足的情況更能滿足實驗需求。

綜上所述，熒光PCR熔解曲線法菌種鑒定與16S rRNA基因測序法具有較高的一致性，能夠用于分枝桿菌菌種的快速鑒定。該方法簡單、快速、高效，對結核病及NTM肺病的診斷具有重要的參考意義。

本研究還存在一定的局限性：(1)本研究的菌株均來自于西安市胸科醫院，未對陜西省其他醫院的菌株進行分析，標本來源較為局限。(2)本研究收集的NTM臨床分離株數量較少，且未收集統計其對應的患者信息，無法進行深入分析患者NTM感染情況，仍需收集更多資料進行進一步研究。(3)熒光PCR熔解曲線法僅能識別19種分枝桿菌，對于超出試劑盒識別范圍的菌種需進行16S rRNA基因測序法進一步驗證。未來筆者將積累更多的NTM臨床分離株進行鑒定，收集其相關臨床資料并進行藥物敏感性分析，以便為NTM肺病的早期診斷和治療提供依據。