Xpert MTB/RIF Ultra檢測腦脊液對結核性腦膜炎的診斷價值

黃麥玲 孫晴 王桂榮 李文勝 杜亞東 蔡寶云 黃海榮 李琦 初乃惠

結核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染而導致的腦膜非化膿性、亞急性或慢性感染性疾病，發病率雖僅占結核病的1%～5%[1]，但死亡率及中樞神經系統后遺癥的發生率卻高達50%[2]。腦脊液(cerebral spinal fluid，CSF)中找到MTB是TBM診斷的“金標準”，但傳統病原學診斷方法常導致診斷延誤，不利于患者預后。而核酸擴增技術因較傳統方法可明顯提高病原學檢測敏感度，且耗時短，在近些年發展迅速，尤以超敏結核分枝桿菌和利福平耐藥基因(Xpert MTB/RIF Ultra，簡稱“Xpert Ultra”)檢測技術表現突出。

目前，對Xpert Ultra檢測CSF診斷TBM的研究還較少[3-8]，且多存在研究樣本量偏小、研究對象多為TBM并發HIV感染者、研究結果不一致等問題。又由于CSF菌陰(涂片及培養)TBM患者中MTB的荷菌量較培陽TBM患者更少，導致目前還沒有評估Xpert Ultra對CSF菌陰TBM患者診斷價值的相關研究。另外，Xpert Ultra主要通過增加多拷貝序列IS6110/IS1081來提高其檢測敏感度，然而，由于流行的MTB菌株因國家或地區而異，其IS6110/IS1081的數量也差別較大[9-10]，故有必要評估不同地區TBM患者應用Xpert Ultra檢測的診斷價值。為此，筆者通過擴大樣本量來評估Xpert Ultra檢測CSF對我國HIV陰性TBM的診斷價值，為 Xpert Ultra的臨床應用提供依據。

對象和方法

一、研究對象

1.一般情況：連續納入2017年1月至2018年12月首都醫科大學附屬北京胸科醫院就診的189例疑似TBM患者，依據入組及診斷標準最終納入151例患者。其中，TBM患者(TBM組)106例，包括32例確診、55例很可能、19例可能；非TBM患者(非TBM組)45例，包括18例病毒性腦膜炎、12例細菌性腦膜炎、7例隱球菌性腦膜炎、3例惡性腫瘤、3例癲癇和2例腦血管疾病。所有患者HIV檢測和CSF抗酸染色涂片鏡檢均為陰性；TBM患者中有30例因CSF標本少而未行CSF中 MTB的BACTEC MGIT 960液體培養(以下簡稱“MGIT 960培養”)，60例(56.6%)患者在采集CSF前進行了1～120 d的抗結核藥物治療。兩組患者基本人口學及臨床特征見表1。

表1 不同人口學特征及臨床特征在結核性腦膜炎組和非結核性腦膜炎組分布情況

2.診斷標準：按照國際統一的TBM診斷標準[11]分為確診、很可能和可能TBM。(1)確診：具備腦膜炎癥狀或體征，同時具備CSF抗酸染色涂片鏡檢、培養、核酸擴增檢測均陽性，或腦組織病理表現與結核病病理表現一致且同時抗酸染色陽性等MTB病原學任一陽性者；(2)很可能：有頭顱CT或MRI檢查，且TBM臨床評分≥12分；無頭顱CT或MRI檢查者，TBM臨床評分≥10分；同時除外其他疾病，但CSF或頭顱影像學評分至少2分；(3)可能TBM：有頭顱CT或MRI檢查者，TBM臨床評分6～11分；無頭顱CT或MRI檢查患者，TBM臨床評分6～9分；同時除外其他疾病。如果頭顱CT和MRI檢查、腰椎穿刺均未做，則不能診斷或除外TBM。非TBM指需要與TBM進行鑒別診斷的疾病。

3.入組標準：所有因病情需要行腰椎穿刺檢查，且無腰椎穿刺禁忌證并同意入組的疑似TBM患者。有以下情況之一者均需排除：未明確診斷、并發HIV感染、無中樞神經系統疾病癥狀、CSF標本量不足、GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)和Xpert Ultra檢測結果不確定。本研究通過首都醫科大學附屬北京胸科醫院倫理審查委員會批準[編號：(2018)年臨審第(21)號]，且所有患者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.主要儀器及試劑：BACTEC MGIT 960液體培養系統及培養基分枝桿菌生長指示管(美國Becton Dickinson公司)；-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)。Xpert檢測儀、Xpert和Xpert Ultra 檢測試劑盒(美國賽沛公司)；中性羅氏培養基(珠海市銀科醫學工程有限公司)；7H9培養基粉和利福平藥粉(美國Sigma公司)。

2.CSF留取：留取患者腰椎穿刺后常規檢查剩余的CSF標本至少3 ml，其中，1 ml CSF標本凍存于-80 ℃擬行Xpert Ultra檢查，其余CSF直接行Xpert、抗酸染色涂片鏡檢和培養。

3.實驗方法：抗酸染色涂片鏡檢、培養及表型藥物敏感性試驗(簡稱“表型藥敏試驗”)參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[12]進行標準化操作。Xpert和Xpert Ultra的檢測步驟嚴格按照檢測試劑盒說明操作，報無效結果者使用相同樣本重復進行Xpert Ultra或Xpert檢測。

4.結果的判讀：根據循環閾值(Ct)和所檢測探針的陽性情況對Xpert Ultra檢測MTB菌量的半定量進行估計，分為“高”“中”“低”“極低”或“痕量”。Ct值介于15～18.9表示“高”，19～24.9表示“中”，25～28.9表示“低”，29～40表示“極低”，而“痕量”表示IS6110/IS1081陽性但rpoB陰性的少菌標本。

三、統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行數據的統計分析，偏態分布的計量資料以“中位數(四分位數)[M(Q1，Q3)]”表示，兩組間差異的比較采用Manne-WhitneyU檢驗。計數資料采用“百分率或構成比(%)”表示，兩組間差異的比較采用χ2檢驗(當總樣本數≥40，理論頻數≥5時)或Fisher精確概率法(當總樣本數<40，理論頻數<5時)；兩組配對資料的比較采用McNemar卡方檢驗，均以P<0.05為差異有統計學意義。以臨床診斷為參考標準，采用敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、一致率、Kappa值評估Xpert Ultra、Xpert、MGIT 960培養對TBM的診斷效能，其中，敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%，特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%，陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%，陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%，一致率=(真陽性例數+真陰性例數)/總患者例數×100%；Kappa值≥0.75，說明兩種方法診斷結果一致性較好；0.4≤Kappa值<0.75，說明兩種方法診斷結果一致性一般；Kappa值<0.4，說明兩種方法診斷結果一致性較差。采用維恩圖展示Xpert Ultra、Xpert、MGIT 960培養檢測CSF陽性的患者例數。

結 果

一、 Xpert Ultra檢測CSF中MTB的負荷情況

Xpert Ultra對45例非TBM患者的檢測結果均為陰性；而對106例TBM患者的檢測陽性結果為47例，包括14例(29.8%)MTB負荷半定量估計為“低”者，13例(27.6%)為 “極低”者，20例(42.6%)為“痕量”者，無“高”和“中”結果。同時，Xpert對106例TBM患者的檢測陽性結果為26例，其中14例為培養陽性者。

二、 Xpert Ultra檢測CSF對TBM的診斷價值

以臨床診斷為參考標準，Xpert Ultra檢測106例 TBM患者的敏感度和特異度分別為44.3%(47/106)和100.0%(45/45)，而Xpert為24.5%(26/106)和100.0%(45/45)，二者敏感度差異有統計學意義(χ2=16.000，P<0.01)。Xpert Ultra檢測76例行CSF培養的TBM患者的敏感度為44.7%(34/76)，而MGIT 960培養的敏感度僅為18.4%(14/76)，二者敏感度差異有統計學意義(χ2=12.893，P<0.01)。具體見表2。

表2 Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960培養以臨床診斷為參考標準檢測腦脊液對TBM的診斷效能

三、 Xpert Ultra檢測CSF對很可能和可能TBM的診斷價值

Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960培養檢測CSF的陽性者分別為47、26、14例，其中，Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960培養檢測CSF單一陽性者分別為21、2、4例(圖1)。當結合Xpert Ultra檢測結果重新診斷TBM時，55例很可能和19例可能的TBM患者中分別有17例(30.9%)和4例(21.1%)被納入，則對TBM的確診率從30.2%(32/106)提高至50.0%(53/106)。

四、 Xpert Ultra檢測CSF不同培養結果TBM患者的診斷價值

在行CSF標本MGIT 960培養的76例TBM患者中，Xpert Ultra對62例(81.6%)培養陰性患者檢測的陽性率[38.7%(24/62)]明顯高于Xpert[21.0%(13/62)]，差異有統計學意義(χ2=7.692，P=0.003)；而對14例培養陽性患者檢測的陽性率[71.4%(10/14)]與Xpert[57.1%(8/14)]的差異無統計學意義(χ2=0.500，P=0.500)，且Xpert Ultra和Xpert對培養陽性患者的檢測敏感度[分別為71.4%(10/14)和 57.1%(8/14)]均高于其對培養陰性TBM患者的檢測敏感度[分別為 38.7%(24/62)和21.0%(13/62)]，差異均有統計學意義(χ2=4.925，P=0.026；Fisher精確概率檢驗，P=0.017)。

五、 抗結核治療對Xpert Ultra檢測CSF的影響

Xpert和Xpert Ultra對接受抗結核治療TBM患者CSF的陽性檢出率[分別為13.3%(8/60)和20.0% (12/60)]均明顯低于未接受抗結核治療患者[分別為39.1%(18/46)和76.1%(35/46)]，差異均有統計學意義(χ2=9.360，P=0.002；χ2=33.189，P<0.01)。且兩種方法對接受抗結核治療的TBM患者的陽性檢出率差異無統計學意義(χ2=1.125，P=0.289)，但Xpert Ultra對未接受抗結核治療的TBM患者的陽性檢出率明顯高于Xpert(χ2=15.059，P<0.01)。

六、 Xpert Ultra檢測CSF對利福平耐藥檢測結果的分析

14例經CSF培養陽性且完成表型藥敏試驗的TBM患者中，經Xpert和Xpert Ultra同時檢出rpoB基因突變者1例，未檢出rpoB基因突變者5例，與表型藥敏試驗結果一致；另外8例患者中，3例僅Xpert檢出無rpoB基因突變，其中1例Xpert Ultra檢測利福平耐藥結果不確定，2例Xpert Ultra檢測陰性；2例僅Xpert Ultra檢出無rpoB基因突變，其中1例Xpert檢測利福平耐藥結果不確定，1例Xpert檢測陰性；1例Xpert Ultra檢出存在rpoB基因突變但Xpert檢測為陰性；2例Xpert及Xpert Ultra檢測結果均為陰性。另外，62例 CSF培養陰性的TBM患者中，Xpert Ultra和Xpert分別檢出14例和12例發生rpoB突變，其中兩種方法均檢出rpoB基因突變者1例。

討 論

TBM是預后最差的結核病，及時診治能明顯改善患者預后，但目前尚缺乏較理想的診斷方法。Xpert檢測系統因其具有全封閉、全自動化操作、污染可能性小、人為錯誤少、結果精確度高、檢測周期短、敏感度高等優勢[13-14]，已成為具有里程碑意義的結核病診斷新方法。但Xpert對菌量較少標本的檢測敏感度較低[15]，而新一代Xpert Ultra在原有Xpert反應體系及設備上進行了改進，使檢測MTB的低限從Xpert的112.6 CFU/ml下降至15.6 CFU/ml[10]，并縮短檢測周期至84 min，檢測少菌標本(如肺外結核、MTB/HIV雙重感染、兒童結核病等)的敏感度也較Xpert明顯增高[16]。因此，WHO于2017年3月推薦新一代Xpert Ultra檢測方法可以替代Xpert用于結核病診斷[17]。

本研究顯示，在106例臨床診斷為TBM(包括確診、很可能、可能TBM)的患者中， Xpert Ultra檢測CSF診斷TBM的敏感度(44.3%)明顯高于Xpert(24.5%)和MGIT 960培養(18.4%)，差異均有統計學意義，與Wang等[3]對43例HIV陰性TBM患者的研究結果一致。2018年，Bahr等[4]首次應用Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960快速培養對23例HIV陽性的TBM患者進行離心后CSF檢測，在確診和很可能的TBM患者中，Xpert Ultra檢測的敏感度(69.6%)高于Xpert(43.5%)。2020年，Cresswell等[5]采用前瞻性隊列研究的方法進行了51例TBM患者的研究，發現Xpert Ultra檢測CSF的敏感度(76.5%)高于Xpert(55.6%)和MGIT 960培養(61.4%)，結果與上述研究一致。但本研究中，Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960培養檢測CSF的敏感度均低于文獻[4]研究結果，可能與以下原因有關：其一，研究發現Xpert Ultra檢測CSF培養陽性患者的陽性率高于培養陰性患者，提示Xpert Ultra檢測CSF的陽性率與其荷菌量相關。其二，基于有研究認為HIV陽性的TBM患者CSF中的MTB荷菌量高于HIV陰性的TBM患者[18]，本研究未納入HIV陽性TBM患者，而文獻[4]納入了HIV陽性的TBM患者。其三，本研究以確診、很可能、可能的TBM患者作為研究對象，而文獻[4]僅以確診和很可能TBM患者作為研究對象，使得本研究對荷菌量更低的“可能TBM患者”的檢出能力降低，且有可能是非TBM。其四，越來越多的證據表明，較大量的CSF可以增加Xpert及Xpert Ultra診斷TBM的敏感度[7, 19]。本研究采用未離心的1 ml CSF進行檢測，而文獻[4]采用較大量(≥3 ml)的CSF行離心后檢查，增加了細菌負荷，進一步提高了檢測敏感度。最后，Thwaites等[20]研究發現，抗結核治療6～15 d行核酸檢測的敏感度(28%)明顯低于抗結核治療前(38%)，Donovan等[7]也在隨訪Xpert Ultra、Xpert基線研究中發現，治療3～4周后的TBM患者檢測陽性率明顯下降，與本研究結論一致。

2020年，Donovan等[7]使用Xpert Ultra檢測CSF對TBM的診斷價值進行了一項前瞻性多中心隨機對照研究，發現在HIV陰性TBM(包括確診、很可能、可能TBM)患者中，Xpert Ultra 檢測的敏感度(38.9%)與Xpert(22.9%)差異無統計學意義(P=0.23)。但本研究兩者敏感度的差異有統計學意義(P<0.01)。可能與該研究樣本量是按照Xpert Ultra檢測敏感度應至少高于Xpert的25%設計的，當Xpert Ultra檢測敏感度不足25%時，則不能得出差異有統計學意義的結論[7]；而本研究的樣本量多于Donovan等的研究，且為同一樣本配對研究，更利于得到有效結果。

對62例CSF培養陰性的TBM患者而言，Xpert Ultra檢測CSF的陽性檢出率(38.7%)明顯高于Xpert(21.0%)，提示Xpert Ultra對CSF涂陰培陰TBM患者的診斷優勢更為明顯。本研究納入的所有TBM患者的CSF涂片檢查均為陰性，且有81.6%(62例)的患者CSF的培養結果也為陰性，Xpert Ultra檢測CSF可使其中38.7%的患者獲得確診，較Xpert的確診率提高了17.7%，對避免神經系統后遺癥的發生和改善患者預后有重要意義。

本研究還顯示，Xpert Ultra、Xpert和MGIT 960培養對HIV陰性TBM患者CSF的檢測特異度、陽性預測值均為100.0%，與其他研究一致[3-7]，也提示Xpert Ultra檢測CSF的陽性患者不會出現誤診。然而，本研究Xpert和Xpert Ultra的檢測敏感度分別為24.5%和44.3%，陰性預測值分別為36.0%和43.3%，提示當兩種方法檢測結果為陰性時均不能除外TBM，仍需研發更有診斷價值的生物標志物以協助診斷TBM。

據報道，如果沒有快速診斷和二線抗結核治療方案的合理應用，利福平耐藥TBM的死亡率將接近100%[21]。本研究中，Xpert Ultra檢出2例利福平耐藥TBM患者，其中1例與表型藥敏試驗結果一致。由于Xpert技術的廣泛推廣，全球130個國家在2010—2016年間應用Xpert技術對2300多萬例患者進行了檢測，使全球耐多藥結核病的檢出數量增加了3～8倍[22]。而Xpert Ultra運用了高分辨率熔解曲線技術，能更好地區分rpoB突變種類，可將“沉默突變”報告為“敏感”，且可靈敏地在混合感染中檢測出利福平耐藥情況，較Xpert技術進一步改進。然而，本研究應用Xpert Ultra檢測利福平的耐藥結果并未體現出其優于Xpert，這可能與研究樣本量太少有關。

本研究Xpert Ultra檢測陽性的47例TBM患者中，20例(42.6%)患者MTB負荷定量為“痕量”，這一結果主要通過新增添的IS6110和IS1081序列而獲得，但IS6110的拷貝數在不同譜系的分枝桿菌中存在較大差異[9]，是不同地區Xpert Ultra診斷TBM敏感度存在差異的原因之一，也是本次研究的意義之一。如L1譜系含有的IS6110數量較少，而L2、L3和L4譜系的分離株中則含有20多個IS6110拷貝[9]，其中L2譜系中的現代北京基因IS6110最豐富[23]；Chen等[24]報道，中國73.9%的肺結核屬于現代家系2，24.8%屬于家系4，0.92%屬于家系3，0.33%屬于家系1；而來自烏干達和越南的患者，則分別以家系4和家系2為主[5，7]。雖然“痕量”結果不能獲得rpoB基因耐藥突變情況，但這一結果足以指導臨床醫生及時開始抗結核藥物治療。

本研究有60例(56.6%)TBM患者在采集CSF前進行了抗結核藥物治療，導致本研究主要結論(Xpert Ultra檢測CSF診斷TBM的敏感度明顯高于Xpert和MGIT 960培養)可能受到這部分患者的影響，不能更客觀、全面地分析抗結核藥物治療前Xpert Ultra檢測CSF對TBM的診斷價值。但本研究也對采集CSF前未接受抗結核治療的患者進行了分層分析，發現Xpert Ultra對未接受抗結核治療的TBM患者檢測的敏感度明顯高于Xpert。

總之，Xpert Ultra檢測CSF診斷HIV陰性TBM的敏感度明顯高于Xpert和MGIT 960培養，尤其對MTB培養陰性的TBM患者的陽性檢出率明顯優于Xpert，是目前診斷TBM最佳的病原學檢測方法，值得臨床推廣應用。但其結果會受到抗結核藥物治療的影響，建議疑似TBM患者盡量在抗結核藥物治療前進行CSF的Xpert Ultra檢測。