精神分裂癥患者的差異代謝物篩選方法研究及應用*

劉 娟 劉 壯 王 菲，3△

【提 要】 目的 應用單變量分析聯合正交偏最小二乘判別分析(orthogonal signal correction partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)探索精神分裂癥患者與健康對照者的代謝譜差異。方法 收集118例精神分裂癥患者與123例健康對照者的血漿并進行非靶向代謝組學檢測，運用非參數檢驗聯合OPLS-DA模式識別方法篩選差異代謝物，然后進行通路分析探索紊亂的代謝通路。結果 基于非靶向代謝組學技術檢測到669個代謝物，聯合非參數檢驗(Wilcox-Mann-Whitney test)與OPLS-DA方法篩選出52個差異代謝物(P<0.05，VIP>1.5)，主要涉及糖代謝、氨基酸代謝和脂代謝。通路分析結果顯示，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝通路與三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環失調相關(FDR<0.05)。結論 應用單變量分析聯合多元模式識別技術進行精神分裂癥的代謝組學數據分析，能夠識別與疾病分子機制相關的差異代謝物，有助于了解疾病的本質并為精神分裂癥的診斷、干預及治療提供依據。

精神分裂癥(schizophrenia，SZ)是一種嚴重的精神障礙，全球患病率約1%，通常伴隨認知、情感體驗、社交能力的損害，多發病于青壯年，病情反復，給患者、家庭和社會造成了沉重的經濟負擔[1-2]。精神分裂癥的病因復雜，目前主要的假說有神經遞質紊亂假說和神經發育障礙假說，但其確切的分子機制迄今不明[3]。神經細胞代謝的紊亂可能導致神經發育和腦結構的異常，即使是微小的代謝率改變也會影響中樞神經遞質如多巴胺、乙酰膽堿、Y- 氨基丁酸(Y-aminobutyric acid,GABA)的釋放和合成[4-5]。研究發現，精神分裂癥患者前額葉皮質葡萄糖代謝率降低，這可能與其受損的認知功能密切相關[6]。越來越多的證據提示，精神分裂癥的發病不僅僅是大腦結構功能的改變，更可能是一種全身系統性疾病，因此從系統水平描述機體整體改變對理解復雜疾病的病理生理變化尤為重要[7-8]，同時也為精神障礙的診斷、預防和治療提供了新的思路。

近年來，隨著代謝組學逐漸應用于精神疾病的研究，并發現精神分裂癥與廣泛的代謝紊亂密切相關，如能量代謝相關代謝通路、抗氧化系統相關代謝通路、神經遞質代謝、氨基酸(如谷氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，精氨酸，組氨酸，牛磺酸，脯氨酸)代謝、脂肪酸代謝、磷脂代謝[9-12]等。

精神疾病的代謝組學分析產生信息含量豐富的高維小樣本數據，傳統的單變量分析方法無法從海量的代謝譜信息中發現代表組間差異的穩定標志物，這是目前代謝組學發展過程中所面臨的一個重要挑戰[13-15]。正交偏最小二乘判別分析(orthogonal signal correction partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA)是一種新型的多元統計數據分析方法，其最大特點是可以去除自變量中與分類變量無關的數據變異，使分類信息主要集中在一個主成分中，模型變得簡單和易于解釋，判別效果更加明顯。利用OPLS-DA方法來分析代謝組學數據，得到對分類有較大貢獻的差異性物質，從而有助于挖掘疾病代謝模式變化的關鍵信息[16-18]。

本研究基于超高效液相色譜質譜聯用技術(UHPLC-MS)，獲取精神分裂癥患者與健康對照組血漿樣本的非靶向代謝譜信息，聯合單變量統計分析與多元模式識別方法鑒別患者組的差異代謝物，進而發現其紊亂的代謝通路，探索精神分裂癥代謝譜模式的變化，從系統水平對精神分裂癥患者的分子機制進行研究，以期為臨床診斷、干預和治療提供參考。

資料與方法

1.研究對象

患者組由中國醫科大學附屬第一醫院門診收集的118例精神分裂癥患者組成。納入標準：18歲以上患者符合精神障礙診斷與統計手冊(第四版)(diagnostic and statistical manual of mental disorders-IV version，DSM-IV)軸I精神分裂癥診斷標準；18歲以下患者符合精神障礙調查篩查表及半定式診斷檢查(the schedule for affective disorders schizophrenia for school-age children-present and lifetime version,K-SADS-PL)精神分裂癥診斷標準；年齡11～55歲。健康對照組通過社會招募納入與患者組性別、年齡、身體質量指數(body mass index，BMI)相匹配的健康人，共123例。納入標準：無精神疾病障礙的診斷史及家族史；11～55歲。所有診斷會談均在中國醫科大學附屬第一醫院精神醫學科完成，由2名經培訓的精神科專業人員獨立評估，使用簡明精神病評估量表(brief psychiatric rating scale，BPRS)評估精神癥狀的嚴重程度。

全部受試排除標準：(1)神經系統或其他精神疾病障礙診斷；(2)重大軀體疾病史；(3)藥物、酒精濫用或依賴史；(4)合并內分泌系統疾病如糖尿病、高血壓、高脂血癥；(5)懷孕或哺乳期婦女。

本研究獲得中國醫科大學倫理委員會批準，且所有受試者在入組前被詳細告知研究目的、方法和風險，均自愿參加并簽署知情同意書。

2.非靶向代謝組學分析

采集所有參與者的外周血樣本，取肘靜脈血5ml于EDTA抗凝管中，血液樣本于2000g離心10min，分離出血漿樣品置于-80℃冰箱保存。在代謝組學分析前先進行樣品預處理，將血漿樣本取出，于4℃解凍，加入代謝組提取液以沉淀蛋白，渦旋，離心，復溶后干燥保存，直至檢測。血漿代謝組學信息在Ultimate 3000超高效液相色譜與Q Exactive Orbitrap質譜儀(UHPLC-HRMS)(Thermo Scientific，San Jose，USA)串聯儀器上采集。實驗測定過程中加入質量控制(QC)樣本的測定，每30個樣本加入一個QC樣本，以確定樣品數據的可靠性和可重復性。數據預處理通過Compund Discoverer version 2.1和TraceFinder software version 4.1(Thermo Scientific，USA)軟件完成，包括峰對齊、峰檢測參數設定、峰面積提取和數據歸一化。統計分析通過SPSS 25.0和SIMCA-P 14.1完成。

3.統計分析與生信分析

采用單變量與多元模式識別技術結合的方法篩選差異代謝物，其中單變量分析根據數據的正態分布情況選擇獨立樣本t檢驗或者非參數檢驗(Wilcox-Mann-Whitney test)，采用FDR方法進行校正，P<0.05認為差異有統計學意義；多元模式識別技術采用正交偏最小二乘判別分析區分組間代謝譜差異，通過

OPLS-DA建模獲得變量重要性評分(variable importance in projection，VIP)評價模型中變量對類別區分的貢獻程度。以P<0.05且VIP>1.5的變量作為差異代謝物，并通過MetaboAnalyst 4.0(http：//www.metaboanalyst.ca/)在線平臺對差異代謝物進行通路分析，通路分析FDR<0.05被識別為顯著改變的代謝通路。

結 果

1.所有研究對象的基本特征

兩組受試對象在性別、年齡、身體質量指數方面差異無統計學意義(p>0.05)，在簡明精神病評定量表得分的差異有統計學意義。見表1。

表1 受試對象的人口學資料

2.篩選差異代謝物

經過UHPLC-MS分析，共獲得669個代謝物，其中正離子模式(ESI+)下檢測到473個，負離子模式(ESI-)下檢測到196個。在QC和內標物校準代謝物的響應后，90.8%的代謝物在正模式下相對標準偏差RSD<20%，95.4%的代謝物在負離子模式下的RSD<20%，表明本次非靶向代謝組學分析表現出極好的穩定性與可重復性。

如圖1所示，數據不服從正態分布，故聯合非參數檢驗(Wilcox-Mann-Whitney test)與OPLS-DA方法進行差異代謝物的篩選，發現52個代謝物(P<0.05，VIP>1.5)在患者組中改變，包括糖代謝的中間代謝產物的水平降低，如葡萄糖/果糖，甘油酸，檸檬酸/異檸檬酸，延胡索酸和蘋果酸；氨基酸代謝的中間代謝產物的水平降低，如酰基化的苯丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，色氨酸，天冬酰胺；不飽和脂肪酸代謝相關的代謝物的升高，如棕櫚油酸和油酸；甾體代謝物水平的降低以及磷脂代謝物的改變。

圖1 精神分裂癥患者組與健康對照組之間差異代謝物的類別

3.生信分析

如圖2所示，進一步的通路分析結果顯示，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝通路與三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環失調相關(FDR<0.05)。

圖2 通路分析結果

討 論

本研究對精神分裂癥患者與健康對照者進行血漿代謝譜信息采集，采用單變量分析聯合多元模式識別方法進行差異代謝物的篩選，發現患者組存在廣泛的糖代謝和氨基酸代謝相關代謝物水平的降低，不飽和脂肪酸水平的升高，甾體代謝物的降低，以及膜磷脂代謝的紊亂。患者組上述改變的代謝譜是圍繞以三羧酸循環為核心的能量代謝紊亂展開的。

在本研究中，患者組TCA循環中的檸檬酸/異檸檬酸、琥珀酸、延胡索酸和蘋果酸明顯低于健康對照組(圖3)，表明精神分裂癥患者存在TCA循環代謝率的降低。先前的研究發現支持這一結果，Liu和Cai等人發現精神分裂癥患者存在延胡索酸和檸檬酸水平的改變[19-20]；Bubber等人針對首次發作精神分裂癥患者的尸檢研究發現其大腦中TCA循環的一系列酶水平顯著改變[21]。綜上所述，TCA循環的改變可能對機體與大腦代謝產生深刻的影響并導致精神分裂癥的發病。

近年來，關于精神分裂癥的發病機制，有研究提出線粒體功能與能量代謝障礙假說[22-23]。能量代謝不僅包含糖代謝，還涉及到大部分脂類與氨基酸的合成與氧化分解。根據本研究結果，精神分裂癥患者表現出葡萄糖/果糖和氨基酸代謝的代謝物水平降低，這與之前的研究發現一致[24-25]。葡萄糖是能量的主要來源，先前的多個研究均發現精神分裂癥患者尸檢腦組織、腦脊液和外周血中糖代謝相關的代謝物及酶水平等顯著降低，提示糖代謝的降低與精神分裂癥的認知功能、語言交流等癥狀密切相關[26-29]。其中，色氨酸與神經遞質5-HT的合成與代謝有關，而GABA是一種抑制性神經遞質，這些氨基酸的降低表明精神分裂癥存在神經遞質代謝的紊亂[30]。此前已有研究報道，精神分裂癥患者的脂代謝如磷脂，甾體代謝物等改變[31]，提示神經細胞膜及神經元活動相關脂質的異常參與精神分裂癥的分子機制。不飽和脂肪酸如棕櫚油酸和油酸的神經保護作用已有報道，Yang等人基于代謝組學的研究發現精神分裂癥患者提示上調的脂肪酸分解代謝可能是由于代償下降的糖代謝水平，彌補能量供應的不足[25]。結合以上發現，能量代謝的紊亂可能進一步導致廣泛的糖、脂、氨基酸、神經遞質代謝的改變，與精神分裂癥的發病密切相關。

綜上所述，在精神分裂癥的代謝組學研究中，基于多元統計模式識別方法對信息量巨大的代謝組學數據進行分析，有利于挖掘與疾病病理生理機制相關的代謝特征。本研究利用單變量分析聯合多元模式識別方法篩選差異代謝物，進一步發現了以TCA循環為核心的能量代謝障礙在精神分裂癥發病中的重要作用。未來針對能量代謝相關分子改變的研究將有助于了解精神分裂癥的本質，成為研究其發病機制的突破口。