甘蔗根腐病及其致病鐮刀菌研究進展

任慶肖，張金旭，張木清

(1廣西大學農學院，廣西南寧530000；2廣西甘蔗生物學重點實驗室，廣西南寧530005；3亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧530005)

0 引言

甘蔗是我國最重要的糖料作物，其產糖量占全國食糖總產量的90%以上[1]。同時，甘蔗是世界上第2大生物能源作物，提供了全球約80%的糖和40%的乙醇產量，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區[2]。當前我國甘蔗主產區為廣西、云南和廣東3省，其中廣西地處熱帶和亞熱帶氣候，占全國甘蔗生產總量的60%[3]。甘蔗是禾本科宿根作物，經過連年種植，病原菌在植株體內或土壤中逐年積累，造成病害嚴重，種性退化，對甘蔗高產高糖構成嚴重威脅[4]。病害是抑制甘蔗生長和制約蔗糖產業發展的重要因素，據統計，已知的甘蔗病害在全球范圍內共有160多種，在我國有50多種屬于侵染性病害[5]。甘蔗根腐病是一種發生在甘蔗根部的土傳性病害，在全球范圍內均有發生，是制約甘蔗產業持續健康發展的因素之一。鐮刀菌種類繁多，植物病原鐮刀病菌多具土傳性，能夠引起多種作物的枯萎病、梢腐病和根腐病等，是最具經濟破壞性的真菌致病菌群之一[6]。甘蔗根腐病2018年在中國廣東首次被報道，在拔地拉根系中發現并分離出引起甘蔗根腐病的鐮刀菌(Fusarium commune)，其感病植株的根系呈褐色或腐爛、長勢弱、活力差，造成大面積減產[7]。Fusarium commune是尖孢鐮刀菌的近緣種，近年來此菌逐漸被發現，其能夠引起豌豆、白松、康乃馨、玉米、胡蘿卜[8]、道格拉斯冷杉[9]、美國森林苗圃[10]、水稻[11]、大豆[12-13]、煙草[14]、豇豆[15]、番茄[16]、軟棗獼猴桃[17]、鵝不食草[18]、龍膽[19]、辣根[20]等多種作物的根腐病，此外還可導致煙草莖腐病[21]、冬瓜葉斑病[22]、玉米穗腐病和莖基腐病[23-24]、荷花腐敗病[25]、荸薺枯萎病[26]、百合枯萎病[27]、花旗松幼苗立枯病[28]等，可見Fusarium commune是一種地理分布和寄主范圍廣泛的致病菌。所以加強甘蔗根腐病的檢驗檢疫、病害檢測和綜合防控非常重要。本研究概述了甘蔗根腐病及其病原菌種類、分離與鑒定、生物學特征和致病機理等方面的研究進展，并提出針對性的防控策略，展望以后研究的方向和急需解決的問題，希望為我國的甘蔗根腐病防控和未來抗病分子育種提供參考。

1 甘蔗根腐病病害基本情況

1.1 甘蔗根腐病的分布與危害

從19世紀末開始一直持續到21世紀，甘蔗根腐病一直受到甘蔗界的廣泛關注。20世紀20年代，美國路州由多種腐霉引起的甘蔗根腐病爆發[29]，后在爪哇、西印度群島、夏威夷、路易斯安、澳大利亞等地根腐病也陸續被報道[30-31]。1980年中國臺灣地區首次報道甘蔗根腐和莖基腐病[32]。2015年墨西哥首次報道甘蔗莖腐病，其患病的甘蔗表現出莖和根腐爛的癥狀[33]。2016年DESHMUKH N J提出甘蔗枯萎病和根腐病是馬哈拉施特拉邦(印度)甘蔗種植的主要威脅[34]。2018年中國廣州甘蔗種植區首次發現根腐病[7]。2020年印度尼西亞蔗區報道與臺灣地區相似的甘蔗根腐和莖基腐病，其造成嚴重的減產[35]。甘蔗根腐病發生后輕則引起植株枯萎黃化，植株萎縮生長緩慢，分蘗數減少。重則致使植株死亡，造成大面積減產，在宿根地中，土壤中殘留病原菌也會影響甘蔗出芽。

1.2 甘蔗根腐病病害的典型特征

甘蔗根腐病主要表現為中胚軸和整個根系逐漸變褐、變軟、腐爛，根系生長嚴重受阻；植株矮小，葉片發黃，幼苗死亡。甘蔗發病初期葉片呈黃色，生長緩慢，根部呈黃褐色，附著土壤的能力開始減弱，植株地上部分難以觀察到明顯變化；發病中期，根部呈現紅褐色，附著土壤的能力進一步減弱，次生根數目減少；發病后期葉片干枯，根部呈黑褐色并且大多數已經腐爛，附著土壤的能力喪失，嚴重時植株枯黃而死(圖1)。

圖1 甘蔗根腐病田間表現

1.3 甘蔗根腐病的傳播途徑與流行規律

近年來，甘蔗根腐病在果蔗種植地區持續加重，主要有以下幾個因素：一是氣候影響，甘蔗在國內主要種植在廣東、廣西、云南、福建等地，栽種之后雨水天氣較多，造成田間持水量高，空氣濕度大，透氣性差，這種條件正適合主要病原菌的滋生侵染；二是目前國內主栽品種對于根腐病抗性較差，容易感染此病害，而且多數蔗農采取宿根種植，病原菌殘留在土壤內，所以病害連年加重；三是廣東高發地區土壤多為黏土，深耕機械作業困難，呈酸性(pH 3～5)，有利于病原菌生存與繁殖；據調查，該病發生與耕作習慣也有一定關系，根腐病重災區農戶施用大水大肥，肥料撒施于土壤表面，大水漫灌后肥料溶于表層土壤，所以根系多存在于土壤淺層部分吸收養分，不利于根系下扎。而且發病初期用藥量多，也使得病原菌抗藥性加強，后續防治難度加大。此外，該病在發病前中期不易發現，一般甘蔗栽培后5～7個月左右才會出現明顯癥狀。該病病原菌主要通過水、泥土進行傳播，輪作水稻、西芹等作物會加快病菌傳播。

2 甘蔗根腐病致病菌概述

2.1 甘蔗根腐病致病菌

能夠導致甘蔗根腐病發生的主要病菌有Pythium arrhenomane、Pachymetra chaunorhiza[29-31]、Xylariasp.[32]、Macrophomina phaseolina、Fusarium moniliforme.andPythium gramenicolasp.[33]、Fusarium commune[7]、Xylaria arbuscula[34]。Pythium arrhenomanes在CMA培養基上菌絲呈白色，無隔膜。附著在卵孢子上的雄器數在1～6個之間，可觀察到游動的孢子囊。Pachymetra chaunorhiza的卵孢子由細長的營養菌絲單獨發育而成，或由小菌絲結簇而成，較大，具有多個疣狀突起。雄器多生于卵孢子梗，膨脹并與疣之間的卵孢子頂端接觸。Macrophomina phaseolina在PDA上菌落密集生長，開始呈灰色，然后逐漸變黑，菌核在5～10天后產生，分生孢子座通常為黑色，單生球狀，具截形孔洞。產孢細胞透明，倒梨狀或近圓柱狀。分生孢子透明，圓柱形或橢圓形，單細胞。Fusarium commune可在PDA平板上25℃恒溫箱環境下進行培養，氣生菌絲呈絨毛狀，可產生大小分生孢子，小孢子呈橢圓形，大孢子呈月牙形。Xylaria arbuscula在OA培養基上菌落呈棉白色，從中心開始變暗，培養4天后，在黑暗區域和培養皿邊緣觀察到白尖疊層結構。有性子座筆直，單生或叢生。子囊孢子為橢圓形，末端為窄圓形，側腹部存在直的芽縫。

2.2 致病鐮刀菌生物學特性

《真菌鑒定手冊》[36]所描述的鐮刀菌株屬下真菌的主要特征：分生孢子梗單生或集成分生孢子座，細長或粗短，單枝或分枝，或產生輪輻狀排列的瓶形小梗。分生孢子無色，變異很大，常埋藏于膠質物內，有大小型2種：大型孢子多細胞，微彎或兩端尖而彎曲顯著，鐮刀形；小型孢子多數單細胞，卵形或長圓形，單生或成串，間有2～3細胞構成的，長圓形，直或微彎。在培養中產生大量氣菌絲呈棉絮狀，菌絲在培養基中常產生色素而呈紅、紫、黃等色。

引起不同作物根腐病Fusarium commune也存在一定差異。在PDA平板上菌落呈白色、粉色、淺紫色等顏色，生長過程中會出現顏色的變化，氣生菌絲多呈絨毛狀。小孢子較多，卵形或橢圓形，大孢子月牙形，微微彎曲，兩端均勻變尖，一般為3～5個隔膜。在SNA培養基上分生孢子梗有粗短型單瓶梗、大于25 μm的細長型單瓶梗以及黑暗培養時產生的復瓶梗3種[14,17,25,27]。

從甘蔗根腐病分離出的Fusarium commune菌株在PDA培養基上菌絲緊貼培養基生長，氣生菌絲為絨毛狀，顏色為白色，平均日生長量為7 mm，培養基不變色，在光學顯微鏡下可觀察到大小孢子，小孢子多呈橢圓形，大孢子較少呈月牙形兩端變尖，隔膜一般為1～2個。分生孢子梗可觀察到短粗或細長的單瓶梗以及復瓶梗。

2.3 甘蔗根腐病病原菌分類與鑒定

從1809年Link發現鐮刀菌并命名為粉紅鐮刀菌至今，鐮刀菌的分類一直是相對困難的問題，鐮刀菌在不同培養基和不同生長時期，其菌落顏色和紋理、分生孢子梗形態以及孢子大小等會發生變化甚至會出現亞種間的變化[37]。因此僅通過形態學特征并不能準確地揭示鐮刀菌物種的多樣性[38]。隨著分子生物學技術的發展，基于多基因的系統發育分析可以快速準確地鑒定鐮刀菌種屬之間的關系[39-40]。2003年Skovgaard等人從豌豆根腐病土壤中分離鑒定出Fusarium commune，并確定其為新菌種(即尖孢鐮刀菌復合種的姐妹種)[41]。2013年O'Donnell等人利用基于DNA定向的部分RNA聚合酶II大亞基(RPB1)和第2大亞基(RPB2)的系統發育分析方法[42]，揭示了鐮刀菌屬的起源并提供了一種較為全面的種的分類，將Fusarium commune劃入Fusarium nisikadoispecies complex中[43]。

國內報道甘蔗根腐病主要致病菌為Fusarium commune。Fusarium commune屬于真核生物界(Eukaryota)、子囊菌門(Ascomycota)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、絲核菌科(Hypocreomycetidae)、煙花鐮刀菌復合種(Fusarium nisikadoispecies complex)。Fusarium commune可采用真菌ITS序列通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCT CCGCTTATTGATATGC)[43]，EF1(ATGGGTAAGGA RGACAAGAC)和EF2(GGAAGTACCAGTSATCAT GTT)進行PCR擴增[44]。隨著研究的進一步深入，學者研究出多對Fusarium commune專用引物，例如Stewart[45]等人設計的efFc100F(GGGGTATTTCTCA AAGGCAATATGC)和efFc385R(ATGCGCTCATTGA GGTTGTGG)，朱志賢[46]設計的FO1(GCCATAGGT CAGATAACCAGTT)和FO2(TCACTACTGGTGTCA GAAAGGG)等用于菌株的分子生物學鑒定。

3 甘蔗根腐病致病鐮刀菌接種方法和分級標準

3.1 接種方法

接種方法會對植株發病情況產生很大影響，在病原菌進行致病性鑒定和不同致病性病原菌篩選中可能會產生一定的偏差。高效接種方法可以快捷、準確地找到強致病菌，大大縮短在病原菌篩選中所耗費的時間，提高實驗效率。

甘蔗根腐病病原菌致病力鑒定可采用室內接種法和田間接種法。由于田間各種因素變化較大，加之甘蔗根腐病方面研究薄弱，貿然采用田間接種容易引起較大風險，所以更多采用室內鑒定法。室內鑒定通常采用直接澆灌法、滅菌土盆栽接種法、孢子懸浮液浸泡接種法和針刺法。

直接澆灌法：將純化后的菌株在PDA平板培養5～7天或者在PDW液體培養基培養2～3天后，從培養基上用挑針輕輕刮下孢子，制備濃度為1.0×106CFU/mL的孢子懸浮液。將蔗莖用合適濃度的滅菌靈消毒后在25℃條件(期間保持濕潤)下催芽7天。每株甘蔗接種10 mL孢子懸浮液，對照接種等量無菌水，接種時沿著根系周圍緩緩倒入，保證孢子懸浮液均勻滲入根系周圍。14天后觀察發病情況。

滅菌土盆栽接種法：將純化后菌株在平板上培養5～7天，將菌落打成直徑0.3 cm的菌塊用于接種。將適量滅菌土和滅菌蛭石與適量菌塊混合均勻，將催芽7天后甘蔗種莖栽入其中，對照不混合病菌。接種后在溫室進行培養，14天后觀察甘蔗根系受到侵染情況。

孢子懸浮液浸泡接種法：將純化后的菌株在PDA平板培養5～7天(或者PDW液體培養基培養2～3天后)，從培養基上用挑針輕輕刮下孢子，將孢子懸浮液濃度調至1.0×106CFU/mL。制備充足孢子懸浮液，將催芽7天的甘蔗種莖浸入孢子懸浮液中10～15 s，確保根系充分均勻接觸到孢子懸浮液，然后將種莖移植到滅菌的培養基質和蛭石混合土壤中，置于溫室中培養14天后，觀察發病情況。

針刺法：病原菌純化后在培養基培養5～7天，制備濃度為1.0×106CFU/mL的孢子懸浮液，用無菌注射器將10 mL孢子懸浮液注射至甘蔗種莖中，然后將注射過孢子懸浮液種莖栽培至滅菌蛭石中，2～3周后觀察甘蔗植株的發病情況。

張尚卿[47]等運用莖基接種和浸根接種法對番茄植株進行接種，結果表明，莖基接種根腐病發病率和死亡率均高于浸根接種。夏蕾[48]等采用灌根和全株噴霧2種方法用灰霉病病原菌進行接種，結果表明灌根法發病率和植株癥狀明顯高于全株噴霧法。吳學宏[49]等用西瓜枯萎病菌孢子懸浮液采用灌根法、浸根法和蘸胚根法進行西瓜幼苗接種試驗，浸根法接種發病率高達94.7%。根據筆者的前期試驗，孢子懸浮液浸泡法在接種后效果最好、植株發病率更高，直接澆灌法次之。所以在根腐病接種實驗中更推薦采用浸根法，浸根法可以將孢子均勻的接種在根系，更便于病原菌在不同部位侵染。

3.2 分級評價標準

對于甘蔗根腐病而言，目前還沒有統一的評價標準。現參考大豆[50-52]等作物根腐病的分級標準，為甘蔗根腐病分級標準做出簡單概述。甘蔗根腐病可采取0～4級標準評價(見表1)：0級，根部健康，根系無侵染癥狀；1級，根系出現輕微損傷(0～20%)，顏色開始變為淡褐色，但無腐爛癥狀；2級，受損傷部位開始蔓延(20%～40%)，淡褐色根系部位增多，出現腐爛癥狀；3級，根系受侵染嚴重(40%～70%)、附著土能力急劇下降，新生根明顯減少，受侵染根系淡褐色逐漸轉為黑褐色；4級，整個根系發病嚴重(70%以上)，整根腐爛，地上部分枯萎。

表1 甘蔗根腐病分級標準

4 甘蔗根腐病鐮刀菌侵染與致病機理

致病菌侵染植株以后，會通過不同的部位和方式入侵細胞。部分菌株會首先定植到細胞表面，然后通過細胞間隙或者細胞表面等方式侵入細胞。Christina Hall等[53]對侵染后的菌絲用甲苯胺藍進行染色，觀察植株感染情況，發現分生孢子萌發后在根周圍形成廣泛的菌絲網。菌絲對表皮細胞的穿透最常見于根毛區，在菌絲通過細胞內和細胞間生長侵入皮層之前，首先在根毛和表皮細胞定殖。康振生[54]研究了禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)在小麥穗部的侵染過程，菌絲萌發后首先從細胞間進行生長，隨后突破細胞膜進入細胞，并沒有發現菌絲從氣孔侵入。同時，也有學者通過電鏡對立枯絲核菌侵染馬鈴薯進行研究[55]。

隨著研究的發展，GFP基因被廣泛運用到鐮刀菌、霉菌、炭疽病毒等侵染植物流程的研究當中。黃國存等人利用構建好的禾谷鐮刀菌菌株侵染玉米葉片后觀察到侵襲性菌絲在接種后24 h內生長，36～48 h內在細胞間生長，72 h后完全占據侵入細胞[56]。以草莓根腐病HYG為選擇標記基因進行侵染過程研究，發現孢子附著在根表面，通過芽管侵染根部，菌絲頂端產生吸盤狀結構侵染草莓植株。一旦進入，菌絲生長主要集中在表皮和皮層組織，在定殖后的維管組織中只檢測到少量菌絲[57]。GFP轉化子侵染玉米后發現兩個轉化子都侵染玉米，菌絲從根到莖侵染植株，并延伸到穗部，感染的穗粒引起二次侵染[58]。FO-GFP菌株對西瓜根系進行侵染后發現，1天菌絲開始萌發，2～3天菌絲逐漸進入根系細胞，同時發現侵染過程中茉莉酸(JA)途徑受到影響[59]。劉勇勤[60]利用GFP標記的FOC-4回接感病香蕉(巴西蕉)發現菌絲以2種形式進行擴散，一種是從細胞間隙無規則擴散，另一種是以細胞間擴散和細胞內生長方式交織在一起擴散。草莓炭疽菌發現孢子從細胞間隙向胞內擴散逐漸形成明顯病斑[61]。也有學者在大豆疫霉病[62]、馬鈴薯炭疽病[63]運用GFP轉化子進行侵染過程研究，說明GFP轉化株可以穩定地應用到實驗當中。

鐮刀菌在侵染植株后，會產生多種次生代謝毒素。例如赤霉素會造成寄主生長延緩同時促進自身的生長發育，促進病菌的侵染[64]。鐮刀菌酸可以增加細胞膜的通透性，加速病原菌的侵染進程[65]。此外，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)也是一種多次被報道的鐮刀菌毒素，此毒素不僅作用于植物，對人和動物的健康也有一定威脅[66-68]。

植物受到鐮刀菌侵染時，病原菌會分泌多種促進植物細胞降解的酶，來幫助病原菌穿透植物的防御系統。對于植物而言，植物防御酶是植物抗病能力的一個重要指標，包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等。PAL酶的變化認為是抗病性表現的重要指標[69-70]。利用病原信號誘發健康植株，發現植株細胞壁木質化的同時導致苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶等防御酶系的增加，表明防御酶系會參與寄主細胞壁的木質化過程[71]，在菌株侵入后就會影響這些酶的分泌。Fusarium commune能夠分泌多種纖維素和半纖維素降解酶來分解植物的細胞壁，加速細胞的降解[72]。筆者通過研究發現，引起甘蔗根腐病的Fusarium commune會通過不同的方式侵染細胞，首先孢子會定殖在細胞表面，通過細胞間隙或者從表面穿破細胞，侵入細胞后沿著細胞間隙進行傳播，逐步對根系進行侵染，造成根系腐爛。

5 甘蔗根腐病主要防控措施

5.1 選育和采用抗病品種

由于甘蔗根腐病是由多種病菌混合侵染引起的一種土傳病害，所以選育和利用抗病、耐病品種是防治該病的主要方向。不同品種對于根腐病抗性不同，但很多主流品種不耐儲藏和運輸，生產上仍然缺乏相應高抗品種，因此不斷開發高抗品種是保證甘蔗高產穩產的方法之一。

5.2 切斷病害傳播途徑

甘蔗作為一種種莖栽培的作物，首先在栽培時應當注意砍種機和刀具的消毒清理，減少病原菌的互相傳播；在機械收獲時應當注意收獲刀具消毒和處理。同時加強外地種莖的檢驗檢疫工作，防止病原菌進一步擴散。

5.3 化學防治

篩選合適的化學藥劑，可以為防治Fusarium commune引起的甘蔗根腐病提供依據。李潤根[27]等人的室內毒力測定試驗表明，75%肟菌·戊唑醇對Fusarium commune的毒性最強，抑菌效果最好，這與張河慶[15]等人的結果相同。朱志賢[46]在荸薺枯萎病的防治研究中發現，10%苯醚·戊唑醇對室內Fusarium commune菌絲生長的抑制效果最好，其次是25%多菌靈、40%氟硅唑等。李慶[73]研究發現戊唑醇對Fusarium commune活性的抑制效果最好，并將其應用在玉米種子包衣處理中，有效提高了玉米出苗率，這對甘蔗進行種莖藥劑處理以防治根腐病提供了一定的參考價值。

播種前采用咯菌腈、烯唑醇、戊唑醇等質量效果較好的殺菌劑包衣拌種。目前生產上防治甘蔗根腐病藥劑報道較少，主要為50%異菌脲、25%咪鮮胺，在甘蔗小培土時4 kg 50%異菌脲溶于200 kg水中(公頃藥量)，稀釋后將噴霧器噴頭噴片去掉，將藥液噴淋在甘蔗根莖部；培大土之后再次施藥，藥效持續時間約為4個月，能夠減少部分損失。也有農戶在播種前施用112.5 kg/hm2高錳酸鉀，整塊地泡水10天對地塊進行消毒，對防治根腐病有一定效果。

5.4 加強田間管理，改進栽培方式

播種前對田塊進行消毒，采用效果較好的殺菌劑包衣拌種，田間增施有機肥、磷肥和鉀肥，提高甘蔗的抗病和耐病能力；及時清除田間病株殘體，防治根部害蟲，以便減少土壤菌源和其它病原菌的侵入途徑。

6 展望

根腐病是甘蔗主要真菌性病害之一，目前我國果蔗的主產區廣東省蔗區發病嚴重，對果蔗行業的健康發展構成很大威脅。目前我國蔗區Fusarium commune的遺傳變異逐步地被發現，可能存在多種株系，已經造成了多種作物的不同病害。根據甘蔗根腐病的傳播和發病流行規律，我國蔗區存在該病害爆發流行的風險，未來有可能成為甘蔗的流行病害，應該引起一定重視，同時進一步加強對發生流行規律、監測防控機制和致病機理等方面的研究。

甘蔗的遺傳背景復雜以及不同地區的甘蔗栽培手段不同，受環境影響較大，極大地阻礙了甘蔗常規育種進程。而且目前對于Fusarium commune引起的甘蔗根腐病研究還停留在較為初步階段。對甘蔗根腐病的致病菌種類、互作侵染關系研究有待完善，接種方法、分級標準也有待進一步發掘。根腐病的發生日益嚴重，而很多先進的育種方法暫未應用到甘蔗根腐病的育種進程中來，所以應進一步開展對該病害的研究。隨著生物信息學技術和高通量測序技術不斷發展，利用轉錄組測序、蛋白組測序、單細胞轉錄組測序等技術，開展更精細的病原菌與植物互作機制的研究，將對未來病害防治、分子育種產生更加深遠的意義。