WPI?PAs膠粒在NaCl作用下的團聚動力學及團聚體分形結構

謝彩鳳，何志成,伍春嫻，蔣贛，魏丹

（廣東藥科大學醫藥化工學院/廣東省化妝品工程技術中心，廣東中山 528458）

乳清分離蛋白（Whey Protein Isolate，WPI）不僅具有極高的營養價值和生物活性，而且具有良好的凝膠特性，常被用于食品、醫藥等領域[1-2]，WPI的凝膠受離子濃度、電解質類型、溫度、pH等因素的影響[3-4]。前期，本課題組以CaCl2做電解質，研究了WPI常溫下在慢速團聚（reaction limited aggrega‐tion，RLCA）條件下的團聚動力學和團聚體結構[5]。本研究選用另一種含有單價陽離子Na+的電解質，用廣角光散射儀的動態光散射（dynamic light scat‐tering，DLS）方法和小角光散射儀的靜態光散射（Static Light Scattering，SLS）方法，研究不同電解質類型對WPI的團聚動力學和團聚體結構的影響，擬為蛋白質的分析檢測以及蛋白質團聚體在多孔材料和藥物緩釋領域的應用提供方法指導。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

針頭式過濾器（25 mm GD/X，濾紙孔徑0.45μm，英國Whatman公司）；廣角光散射儀、BI-200SM角度測量器（美國Brookhaven Instruments）配以Ventus LP532型激光發射器（英國Laser Quantum），入射光波長為λ1=532 nm，測角范圍20～145°；Mastersizer 2000小角光散射儀（英國Malvern），入射光波長為λ2=633 nm，測角范圍0.02～40°。

1.2 試劑

WPI粉末（BiPro，JE345-3-420，Davisco Foods International Inc.，美國明尼蘇達）；疊氮化鈉（NaN3）、NaOH（固體）、鹽酸溶液（0.1 mol/L）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液（HEPES）、NaCl（固態）均為分析純，由Sigma-Aldrich公司提供；超純水（自制）。

2 方法

2.1 WPI的熱變性制備WPI-PAs及性能測量

WPI熱變性制備乳清分離蛋白初級團聚體（WPI-PAs）的方法參見前期的工作[5]，最終得到Cp=50 g/L的膠體分散體，NaN3的最終濃度為3.08×10?3mol/L。配置好的分散體儲存于溫度為4℃左右的冰箱中備用。

2.2 用NaCl誘導團聚實驗及分析檢測

實驗開始前，先用超純水對WPI-PAs膠體分散體和NaCl溶液進行多次稀釋，以免膠體溶液和電解質溶液濃度太高導致團聚實驗過程中局部混合不均而出現大團聚體。然后把稀釋的NaCl溶液倒入膠體分散體中達到設定的電解質濃度Cs（mol/L）、膠粒濃度（固定Cp=2.00 g/L）和設定的pH7.0。平衡幾秒后，將溶液分成兩等份，分別裝入2只WALS專用測試瓶，一瓶置于WALS測試槽（恒溫25℃）進行DLS測量，測量團聚體的平均水力學半徑〈Rh〉與時間的關系；另一瓶置于與測試槽溫度相同的恒溫水槽中保持恒溫，非常緩慢地輕輕來回顛倒，每20～30 min兩瓶交換一次測量，以避免生成的大團聚體在長時間靜止狀態下沉淀到反應器底部?！碦h〉通過Stockes-Einstein方程計算[6]：

SLS測試的制樣方法同DLS，測試時用注射器迅速但輕輕地把團聚體系注入SALS測試槽，在線檢測膠粒的團聚動力學過程。SLS所測得的團聚體的光散射強度I(q)的表達式如下[6-7]：

式中：q是基于散射角θ計算得到的波矢量；I(0)是q=0的散射強度；P(q)是初級團聚體WPI-PAs的形狀因子，由直接測量濃度為2.00 g/L的WPI-PAs分散體得到；〈S(q)〉是電解質誘導團聚得到的團聚體的歸一化形狀因子，對初級團聚體可以認為〈S(q)〉=1；q是基于散射角θ計算得到的波矢量：

式中：n0是分散介質水的折光指數。

團聚體的平均旋轉半徑〈Rg〉*和分形維數Df，可以從〈S(q)〉得到[6,8]:

由方程（4）和（5）所得到的平均旋轉半徑只有在團聚體足夠大時才正確，對小團聚體，如在團聚過程初始階段生成的團聚體，初級團聚體對旋轉半徑的貢獻需要考慮進來：

式中：Rg,0的測試方法見文獻，測量值為70.54 nm。

3 結果與討論

3.1 廣角光散射儀的DLS測試結果

圖1是用DLS測得的WPI-PAs在不同Cs下各體系的平均水力學半徑〈Rh〉隨時間的變化規律。從圖1可見，不同Cs下，〈Rh〉均隨時間的增加而增長，〈Rh〉是直接與粒子的幾何形狀有關的尺寸，〈Rh〉增大表明WPI-PAs發生了團聚，NaCl的加入對體系的穩定性起著一定的破壞作用。同時可以發現，當Cs為3.20 mol/L時，曲線增長非常緩慢，隨著Cs增大，曲線逐漸變得陡峭，〈Rh〉的增長速度逐漸加大，Cs=5.10 mol/L時，曲線最陡，表明此時的團聚速度最快，這是因為電解質中的陽離子Na+屏蔽了蛋白質表面陰離子形成的雙電層，Na+濃度越大，雙電層被屏蔽的越多，團聚速度更快。

圖1 不同NaCl濃度下WPI-PAs團聚體平均水力學半徑（〈Rh〉）隨時間（t）的變化趨勢Figure 1 The hydrodynamic radius,〈Rh〉,as a function of time,t,at the same WPI-PAs concentration but different NaCl concentrations

為了進一步研究WPI-PAs的團聚規律和團聚體結構，引入質量守恒方程（PBE，population balance equation）擬合〈Rh〉-t曲線，膠粒團聚過程中團聚體質量分布可以用PBE模型表述[6,9-11]：

式中：Ni(t)是質量為i的團聚體在時間t的質量濃度；Ki,j是質量為i和j的2個團聚體之間的團聚速率常數，定義如下：

式中：KB=8kT/3μ是Smoluchoeski速率常數（k是波爾茲曼常數，單位是J/K，T和μ分別是分散體的溫度和動力學黏度，單位分別為K和Pa·s）；W是Fuchs穩定性常數，典型DLCA團聚過程其值小于5，而對RLCA團聚其值大于5，W值越大表明團聚速度越慢；乘積項(ij)λ表示在RLCA團聚過程中，團聚體的反應速率隨團聚體質量的增加而增大，指數λ值的范圍一般是0～0.50，DLCA團聚的λ=0。公式(7)和(8)的解能給出整個團聚過程中不斷長大的所有團聚體的質量分布（Ni，i=1,2，……），從Ni就可以計算出團聚體的平均水力學半徑〈Rh〉和旋轉半徑〈Rg〉的值：

式中：Rh,i和Rg,i是質量為i的單個團聚體的水力學半徑和旋轉半徑，典型的無融合膠體在DLCA和RLCA條件下Df值分別在1.75和2.10左右，很多研究結果都證明了這個結論[6,8]。圖1中的連續曲線是用上述方法得到的各濃度下〈Rh〉的擬合結果，相應的擬合參數見表1?？梢?，各個濃度下的擬合曲線都能較好地與實驗值吻合；W值隨Cs的增加而減小，說明隨團聚速度隨電解質濃度增加而加快，因為電解質濃度越大，對雙電層的屏蔽也越有效。得到的Df、W和λ的值均與典型的RLCA條件下不融合膠粒的經驗值相符合，說明在NaCl作用下WPIPAs的所有團聚均在慢速團聚條件下進行，即使在接近常溫NaCl飽和濃度（NaCl常溫下的飽和濃度為6.02 mol/L，由于實驗時需要將配制的NaCl溶液與膠體分散體混合稀釋，所以團聚體系最終能達到的NaCl為5.10 mol/L）時W值仍然很大，是速度較慢的慢速團聚。這與前期用CaCl2誘導團聚在較低濃度出現臨界聚沉值[5]（ccc，critical coagulation con‐centration）的現象不同，這是因為CaCl2溶液中含有二價陽離子Ca2+，其他條件都相同時，ccc值與反離子價態的6次方成反比，Ca2+比Na+能更加有效地屏蔽雙電層[12]：

表1 不同NaCl濃度下用PBE方程對WPI-PAs的〈Rh〉-t曲線擬合得到的擬合參數Table 1 The fitting parameter from the PBE simulations of〈Rh〉-t curve of WPI-PAs under different NaCl concentra‐tions

式中：C是與電解質的陰離子和陽離子性質有關的常數；D是介質的介電常數；T為絕對溫度（K）；A1是范德華引力常數；e是單位電荷。

用2種電解質得到的團聚體在RLCA條件下Df值均為2.10左右，說明用2種電解質得到的團聚體的結構是相似的。分形體一個非常有趣的性質就是自相似性，即同一物質的分形體在不同尺寸時的形狀是非常相似的[13]。正是因為這種自相似性，可以用分形維數Df表征分形體的結構，它代表了分形體中組成成分的緊密程度，Df的值越大說明所得到的團聚體的結構越致密。同一種物質即使采用兩種不同的電解質誘導團聚，在相同的團聚機理下得到的團聚體的形狀也是相似的，這更進一步證明了擬合結果的可靠性。由于用CaCl2誘導團聚會出現ccc，當CaCl2的濃度高于ccc時，團聚會在DLCA下進行，這時形成的團聚體的Df值一般在1.75左右，說明形成了疏松的團聚體[5]，而本文中在所有NaCl濃度下得到的都是結構致密的團聚體。

3.2 小角光散射儀的SLS測試結果

為了進一步驗證實驗結果的可靠性，選擇Cs=4.50 mol/L的濃度再次誘導團聚并且用小角光散射儀的SLS對團聚過程進行測試。圖2（a）和（b）分別是WPI-PAs團聚體的光散射強度I(q)曲線隨時間的演化曲線和相應的不同時間的團聚體的歸一化平均結構因子〈S(q)〉與歸一化的波矢量q×〈Rg〉的函數關系圖。圖2（a）中，在q<2×10?4處不同時間的曲線幾乎重疊，但在q>2×10?4處，I(q)曲線隨著團聚過程的進行逐漸上揚，I(q)的值隨團聚過程的進行顯著增大，這表明團聚體隨著凝膠過程的進行逐漸長大，這種緩慢、漸進的團聚體增長表明WPI-PAs的團聚是在RLCA下進行的。對具有分形結構的團聚體，如果團聚體結構相同，不同時間的團聚體歸一化的平均結構因子〈S(q)〉?q×〈Rg〉曲線將會重疊在一起，而本文得到的圖2（b）中不同時間的〈S(q)〉?q×〈Rg〉曲線確實重疊在一起，說明團聚過程中的團聚體符合分形結構的規律。

圖2 WPI-PAs團聚體的光散射強度曲線隨時間的演化曲線（a）與團聚體的歸一化平均結構因子與歸一化的波矢量的函數關系（b）Figure 2 Typical time evolution of the scattered intensity curves,along the aggregation of the WPI-PAs(a)and the normalized aver‐age structure factor of clusters,at various aggregation times,as a function of normalized wave vector,corresponding to the ag‐gregation systemin(b)

從I(q)?q和〈S(q)〉?q×〈Rg〉曲線得到Df的值，曲線的冪指數區域必須至少跨越2個數量級[8,12]，即團聚體含有50個以上的初級粒子或者〈Rg〉/Rh,0>7且尺寸分布較為單一[14]，團聚體的結構因子才能夠得到一個正確的符合冪指數規律的區間。而本文中由于膠粒團聚速度較慢，曲線的冪指數區域沒有跨越兩個數量級，無法通過此方法求出Df，但是可以根據方程（12）從I（0）對〈Rg〉/Rh,0曲線圖求得Df，因為小團聚體一般〈Rg〉/Rh,0>3時，I（0）對〈Rg〉/Rh,0曲線已經符合分形結構的特征[15]：

式中：Rh,0=29.3 nm，是初級膠粒的水力學半徑，測量方法同〈Rh〉。從公式（12）可以看出，對曲線橫、縱坐標取對數，得到的直線斜率就是Df的值。

圖3（a）是用公式（12）計算得到q=0處的散射光強度I（0）與〈Rg〉/Rh,0之間關系的時間演化曲線，得到的Df值為2.12，與前面用PBE方程擬合〈Rh〉-t曲線得到的值一致。同時，將得到的Df值和前面擬合出的W值代入到PBE方程中，利用公式（9）和（10）分別計算不同時間團聚體的平均水力學半徑〈Rh〉和平均旋轉半徑〈Rg〉的值[圖3（b）中連續曲線]擬合圖3（b）中的實驗值（點線），可以看到擬合值和實驗值非常吻合，得到的λ=0.23，與前文的擬合值非常接近，進一步驗證了實驗結果的可靠性。

圖3 在q=0處的散射光強度與〈Rg〉/Rh,0之間關系的時間演化曲線（a）與〈Rg〉隨時間的變化規律的PBE擬合結果（實線曲線）與實驗結果（空點點線）的比較（b）Figure 3 Time evolution of the intensity at q=0,I(0),as a function of the corresponding〈Rg〉/Rh,0(a)and PBE simulations(solid line)of the time evolutions of〈Rg〉compared with experiments(open symbols)(b)

4 結論

本研究用廣角光散射儀的動態光散射（DLS）和小角光散射儀的靜態光散射（SLS）方法，分析WPIPAs在NaCl作用下的團聚動力學和團聚體結構。DLS研究發現，WPI-PAs的團聚速度隨時間和NaCl濃度的增加而增大，質量守恒方程（PBE）擬合發現，在所有NaCl濃度下的團聚都是在慢速團聚下進行，即使在接近飽和NaCl濃度時仍沒有出現臨界聚沉值。擬合得到的Df值全部在2.10左右，說明形成了結構致密的團聚體。選用其中一個NaCl濃度進一步采用SLS分析發現，團聚體的分形維數Df的值確實在2.10左右，而且將DLS擬合得到的參數和SLS實驗得到的Df值代入到PBE方程中重新計算得到的〈Rh〉和〈Rg〉的計算值與實驗值能夠較好吻合，驗證了實驗結果的可靠性。本文方法能為蛋白質的分析檢測以及蛋白質團聚體在多孔材料和藥物緩釋領域的應用提供可靠的指導。