氟苯尼考自微乳給藥系統的制備及其質量評價

謝蕓 1，吳海燕 1，劉雯君 1，胡巧紅

（1.廣東藥科大學藥學院，廣東廣州 510006；2.廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術研究中心，廣東廣州510006）

氟苯尼考（florfenicol，FF）又名氟甲砜霉素，系甲砜霉素的單氟衍生物，是美國Schering-Plough公司于1988年研發的新型動物專用的第三代氯霉素類廣譜抗生素[1]。從藥效上看，氟苯尼考比氯霉素及甲砜霉素具有更高的抗菌活性[2]，能抑制或殺死耐氯霉素及甲砜霉素的細菌，且沒有潛在的致再生障礙性貧血的缺點，更沒有致畸、致癌和致突變的缺陷。目前，該藥在獸醫臨床上應用非常廣泛，但是氟苯尼考水溶性較差，在水中溶解度為1.51 mg/mL[3]，嚴重影響氟苯尼考的生物利用度。因而，改善氟苯尼考的溶解性能是增加氟苯尼考生物利用度的關鍵[4]。

自微乳給藥系統（self-microemulsion drug deliv‐ery system，SMEDDS）是由藥物、油相、乳化劑和助乳化劑形成的均一澄清液體，口服遇到胃腸液后在胃腸道的蠕動下自發分散形成O/W型、粒徑小于100 nm的乳劑[5-6]。SMEDDS口服后能在胃腸道快速、均勻分布，可作為難吸收、疏水性或易水解藥物的載體[7]。自發形成的乳滴有巨大的比表面積，可提高難溶性藥物的吸收[8]。此外，形成的微乳可保護藥物，避免在胃腸道中被酶解，增加藥物的穩定性；微乳還可通過淋巴循環系統，克服藥物的首過效應[9]。星點設計-響應面優化法是通過描繪效應對考察因素的效應面，從效應面上選擇較佳的效應區，從而回推出自變量取值范圍即最佳實驗條件的優化法。該法具有實驗次數少、精度高等特點，使用起來直觀、方便，常用于制劑工藝和處方篩選[10]。本文設計將氟苯尼考制成自微乳給藥系統（FFSMEDDS），通過偽三元相圖法結合星點設計-響應面法優化處方，以改善氟苯尼考的溶解度，達到速效、高效的目的。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Techcomp FA2004B電子分析天平（上海天美天平儀器有限公司）；VORTEX GENIUS 3渦旋混勻器（德國IKA集團）；TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器廠）；TS-100B恒溫振蕩器[匡貝實業（上海）有限公司]；HPX-9162 MBE數顯不銹鋼電熱培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；NanoBrook 90Plus PALS高靈敏Zeta電位及粒度分析儀（美國布魯克海文儀器公司）；Multiskan FC酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）；JEM-2100HR 200kV透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）。

1.2 試藥

氟苯尼考對照品（四川維克奇生物科技有限公司，批號wkq19080802）；氟苯尼考原料藥（湖北龍翔藥業科技股份有限公司，批號180414）；大豆油（廣州白云山漢方現代藥業有限公司）；油酸（天津市致遠化學有限公司）；檸檬酸三乙酯、辛癸酸甘油三酯、吐溫85、聚氧乙烯蓖麻油（EL）、維生素E琥珀酸酯（TPGS）均由上海麥克林生化科技有限公司提供；吐溫80、聚氧乙烯烷基酚醚（乳化劑OP-10）、聚乙二醇400（PEG400）、丙二醇均由天津市大茂化學試劑廠提供；二乙二醇乙醚（transcutol，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；蒸餾水（屈臣氏集團有限公司）。

2 方法與結果

2.1 HPLC法測定樣品中氟苯尼考的質量濃度[11]

2.1.1 色譜條件 色譜柱：菲羅門Luna C18(2)（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-水（體積比40∶60）；流速：1.0 mL/min；進樣量：20μL；柱溫：室溫；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：224 nm。

2.1.2 氟苯尼考對照品儲備液的制備 精密稱取50 mg氟苯尼考對照品，置于100 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得500μg/mL的對照品儲備液。

2.1.3 專屬性考察 取適量氟苯尼考對照品儲備液，經適當稀釋得到40μg/mL的對照品溶液，將對照品溶液與空白輔料溶液、氟苯尼考自微乳樣品溶液，按“2.1.1 ”項下色譜條件分別進行測定，考察方法的專屬性，結果見圖1。可見，氟苯尼考在6 min左右出峰，空白輔料不干擾氟苯尼考的測定，方法專屬性良好。

圖1 氟苯尼考對照品（A）、氟苯尼考自微乳（B）和空白輔料（C）的HPLC圖Figure 1 The HPLC chromatographs of Florfenicol(A),FFSMEDDS(B)and excipients(C)

2.1.4 標準曲線的繪制 分別精密移取500μg/mL的氟苯尼考對照品儲備液，經適當稀釋得到5、10、20、40、60、80、100μg/mL的 對 照 品 溶 液。按“2.1.1 ”項色譜條件進行測定，以峰面積（y）對質量濃度（x，μg/mL）進行線性回歸，得回歸方程y=42.484x+2.043 4（R2=1），表明在5～100μg/mL范圍內線性良好。

2.1.5 精密度考察 日內精密度：分別精密移取適量氟苯尼考對照品儲備液，用流動相稀釋，得到10、40、80μg/mL的對照品溶液，按“2.1.1 ”項下色譜條件，在同一天內進行測定，結果計算得3種濃度溶液的RSD值分別為0.17%、0.20%、0.15%，符合規定。

日間精密度：取上述低、中、高3個不同濃度的對照品溶液，按“2.1.1 ”項下色譜條件，每天測定1次，連續測定3 d，結果計算得3種濃度溶液的RSD值分別為0.05%、0.03%、0.08%，符合規定。

2.1.6 穩定性考察 分別精密移取適量對照品儲備液，用流動相稀釋，得到10、40、80μg/mL的對照品溶液。分別在0、2、4、6、8、10 h時，按“2.1.1 ”項下色譜條件測定，結果計算得RSD值分別為0.10%、0.03%、0.02%，表明供試品溶液在10 h內穩定。

2.1.7 回收率的測定 取一定量已知濃度的氟苯尼考自微乳樣品液，置于10 mL容量瓶中，加入適量氟苯尼考對照品儲備液，用流動相稀釋定容，制得低、中、高3種濃度的溶液。按“2.1.1 ”項下色譜條件，每個濃度平行測定3次，結果見表1。可見，低、中、高3種濃度溶液的平均回收率分別為99.15%、100.73%、99.92%，RSD分 別 為0.20%、0.16%、0.07%，符合規定。

表1 氟苯尼考回收率測定結果Table 1 Recoveries of Florfenicol

2.2 溶解度的測定

分別取過量氟苯尼考原料藥，置于25 mL帶塞錐形瓶中，加入各輔料5 mL，渦旋混合5 min，于37℃、100 r/min氣浴恒溫振蕩器中振蕩72 h，使溶解達到平衡，將樣品以8 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22μm濾膜，取適量濾液用流動相稀釋后，按“2.1.1 ”項色譜條件測定，計算氟苯尼考質量濃度即為藥物溶解度，結果見表2。可見，氟苯尼考在油相檸檬酸三乙酯中的溶解度顯著大于大豆油、油酸和辛癸酸甘油三酯，在乳化劑吐溫80、OP-10、EL、TPGS中的溶解度優于吐溫85，在助乳化劑transcutol、PEG400中的溶解度明顯大于丙二醇。

表2 氟苯尼考在各輔料中的溶解度Table 2 Solubility of Florfenicol in different excipients

2.3 油相、乳化劑和助乳化劑的篩選

2.3.1 油相與乳化劑相容性考察 稱取比例為4∶6的油相與乳化劑，混合均勻，取一定量混合物滴入37℃、100倍量的蒸餾水中，于轉速為100 r/min的磁力攪拌器中攪拌，記錄自乳化時間和溶液外觀性狀，篩選合適的油相和乳化劑。按文獻[12]方法，目測等級設定為：A級，乳化時間<1 min，溶液澄清或微泛藍光；B級，乳化時間<1 min，溶液略濁，呈藍白色；C級，乳化時間2 min內，溶液較黏稠，呈亮白色不透明液體；D級，乳化時間>2 min，呈灰白色，略帶油狀；E級，難乳化，一直有油滴存在。

從表3可見，檸檬酸三乙酯與乳化劑OP-10及EL形成的微乳的評級較高，故選用檸檬酸三乙酯為油相、乳化劑OP-10和EL為乳化劑繼續篩選助乳化劑。

表3 油相與乳化劑配伍的評級結果Table 3 Grading results of compatibility of oil phases and emulsifiers

2.3.2 助乳化劑篩選 先將乳化劑OP-10、EL分別與助乳化劑按1∶1比例混合均勻，再與油相檸檬酸三乙酯以4∶6的比例混合均勻。取一定量混合物滴入37℃、100倍量的蒸餾水中，于轉速為100 r/min的磁力攪拌器中攪拌，觀察現象并評級（方法參見“2.3.1 ”項），結果見表4。

表4結果顯示，檸檬酸三乙酯為油相、乳化劑OP-10為乳化劑時，與助乳化劑transcutol、PEG400、1,2-丙二醇形成的微乳評級均較高。結合“2.2”項的溶解度測定結果，氟苯尼考在1,2-丙二醇中的溶解度較低，故確定以檸檬酸三乙酯為油相，以乳化劑OP-10、EL為乳化劑，以transcutol、PEG400為助乳化劑，進行進一步篩選。

表4 檸檬酸三乙酯為油相的乳化劑和助乳化劑配伍的評級結果Table 4 Grading results of compatibility of emulsifiers and coemulsifiers for triethyl citrate as oil phase

2.3.3 偽三元相圖法篩選乳化劑、助乳化劑 以檸檬酸三乙酯為油相，分別以乳化劑OP-10、EL為乳化劑，以transcutol、PEG400為助乳化劑，固定乳化劑與助乳化劑的比值（Km）為2，油相與混合乳化劑按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例混合，采用微板稀釋法繪制偽三元相圖。將油相和混合乳化劑以減幅為10μL，從200μL到0μL，水則以10μL的增幅從0μL到200μL，加入96孔板中。每個孔做3個復孔，每個比例以同樣步驟填充，將填充好的96孔板置于孔板振蕩器上振搖30 min使充分混勻，然后用多功能酶標儀于650 nm波長處測定吸光度[13]。以吸光度突變的點為臨界點，采用Origin 8.0軟件繪制偽三元相圖確定微乳區域，結果見圖2。

由圖2可知，當油相為檸檬酸三乙酯、乳化劑為乳化劑OP-10、助乳化劑為transcutol時，形成的自微乳區域最大，故選擇乳化劑OP-10為乳化劑、trans‐cutol為助乳化劑，繼續進行處方優化。

圖2 檸檬酸三乙酯為油相的乳化劑和助乳化劑的偽三元相圖Figure 2 Pseudo ternary phase diagrams of emulsifiers and coemulsifiers for triethyl citrate as oil phase

2.4 星點設計-響應面優化法優化FF-SMEDDS處方

采用二因素、五水平的星點設計-響應面優化法對FF-SMEDDS的處方進行優化。選擇對自微乳形成有顯著影響的2個因素，即油相檸檬酸三乙酯的質量百分比（X1）、乳化劑OP-10與助乳化劑transcu‐tol的質量比Km（X2）。根據偽三元相圖中的自微乳區域范圍，以溶解度（Y）為評價指標，確定各因素的取值范圍，油相的質量百分比（X1）的取值范圍為10%～80%，乳化劑與助乳化劑的質量比Km（X2）的取值范圍為1～9，因素水平見表5。

表5 因素與水平Table 5 Factors and levels

按表6中處方，精密稱取各輔料共6 g于50 mL帶塞錐形瓶中，渦旋混勻5 min，加入過量氟苯尼考原料藥，渦旋混勻5 min。然后置于溫度為37℃、轉速為100 r/min恒溫振蕩器中，振蕩72 h，使溶解達到平衡，將樣品以8 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22μm濾膜，取一定量濾液用流動相適當稀釋后，按“2.1.1 ”項色譜條件測定氟苯尼考質量濃度，即為溶解度。

表6 星點設計優化FF-SMEDDS的結果Table 6 Results of FF-SMEDDSoptimized by central compositedesign

采用Design-Expert 11軟件，以溶解度作為因變量，分別對各因素（自變量）各水平進行二項式擬合，得到方程式：Y=57.970 00?6.472 98X1?5.051 03X2+1.810 00X1X2?1.465 62X12+5.501 87X22，方差分析結果見表7。

表7 方差分析結果Table 7 Analysis results of variance

以上述數學模型為基礎，描繪三維因變量，繪制3D效應面圖，見圖3。由此綜合分析獲得優化處方為：檸檬酸三乙酯31.78%、乳化劑OP-10 34.63%、transcutol 33.59%。

2.5 處方驗證

根據上述得出的優化處方，制備3批FFSMEDDS，按“2.4”項下“精密稱取各輔料共6 g于50 mL帶塞錐形瓶中，……，即為溶解度”操作，測得藥物溶解度為（80.39±0.60）mg/mL（n=3），與預測值（80.28 mg/mL）作比較，按公式：偏差（%）=|預測值-真實值|/預測值×100%，計算得偏差為0.14%，表明星點設計-響應面優化法具有較好的預測效果。此外，測得上述3批FF-SMEDDS的微乳粒徑為（9.34±0.36）nm，PDI為0.111±0.034。

圖3FF-SMEDDS的溶解度3D效應面圖Figure3 Theresponsesurfacegraph(3D)ofthesolubility ofFF-SMEDDS

2.6FF-SMEDDS的制備及質量評價

2.6.1 FF-SMEDDS的制備 星點設計-響應面優化法中測定的為藥物飽和濃度，為避免自微乳給藥系統中藥物處于飽和狀態時易受環境影響而導致藥物析出的問題，所以最終制備藥物濃度低于飽和濃度的FF-SMEDDS。

按“2.4”優化后的處方制備3批FF-SMEDDS：精密稱取各輔料共30g于50mL帶塞錐形瓶中，渦旋混勻5min，加入1.5g氟苯尼考原料藥，渦旋混勻10min得到溶液。

2.6.2 外觀形態 FF-SMEDDS為無色澄清透明的黏稠狀液體，加水自乳化后形成無色、均一透明的微乳，有乳光。電鏡下觀察到自乳化形成的微乳呈類球形，見圖4。

2.6.3 粒徑及分布 取適量FF-SMEDDS，用蒸餾水稀釋100倍，使自乳化形成微乳，測定微乳的粒徑及分布。形成的微乳粒徑分別為（8.88±0.05）nm（PDI=0.139±0.018）、（9.18±0.04）nm（PDI=0.085±0.009）、（9.01±0.03）nm（PDI=0.085±0.008）。

2.6.4 藥物質量濃度的測定 取適量FF-SMEDDS，用流動相稀釋后，按“2.1.1 ”項色譜條件，測得3批FF-SMEDDS的藥物質量濃度分別為48.35、48.08、48.14mg/mL。

2.6.5 離心穩定性 取適量FF-SMEDDS，加水稀釋100倍，使自乳化形成微乳，在3000r/min轉速下離心30min后，觀察外觀形態，可見仍為無色、均一透明的微乳液，無沉淀出現。

圖4FF-SMEDDS自乳化形成微乳的透射電鏡照片Figure4 Transmissionelectronmicrographofthemicro‐emulsionformedbyFF-SMEDDSindistilledwater

2.6.6 穩定性考察 將FF-SMEDDS分別置于4、30℃下，在第0、5、10、15、30d取出一定量樣品，用流動相稀釋后，按“2.1.1 ”項色譜條件測定藥物濃度。另取適量樣品，用蒸餾水稀釋100倍，使自乳化形成微乳，測定粒徑及分布，結果見表8。結果顯示，FF-SMEDDS在4、30℃條件下放置30d，藥物濃度的變化幅度均小于5%，自乳化后的微乳粒徑在8.64～9.54nm之間，均無明顯變化，說明體系在4℃和30℃條件下穩定。

表8 FF-SMEDDS穩定性考察結果Table 8 Stability of FF-SMEDDS

3討論

通常，自微乳油相的質量百分比越大，對藥物的溶解能力越強，但油相的用量對自微乳體系的穩定性有較大的影響[14]。本研究發現，氟苯尼考在檸檬酸三乙酯中的溶解度顯著大于其他油相。這是因為與油酸、大豆油相比，辛癸酸甘油三酯、檸檬酸三乙酯的碳鏈更短，極性更大；與辛癸酸甘油三酯相比，檸檬酸三乙酯碳數更少，且支鏈更短，因此，推測檸檬酸三乙酯的極性最大，而氟苯尼考結構中含有鹵素及磺酸基，極性與其最為接近，所以氟苯尼考能較好地溶解在檸檬酸三乙酯中。相容性考察發現，檸檬酸三乙酯與乳化劑形成的微乳的評級較高，故選用檸檬酸三乙酯為油相。乳化劑的種類及用量影響微乳的形成和穩定性；助乳化劑則主要起增加藥物溶解度、調節親水親油平衡值（hydro‐phile-lipophilebalance，HLB）的作用，并能與乳化劑形成復合界面膜，促進微乳形成且增加其穩定性[15]。O/W型自微乳給藥系統一般采用穩定性高、毒性低、HLB值為8～18的非離子型表面活性劑。本研究所選的乳化劑均為HLB值在該范圍內的非離子表面活性劑，乳化劑OP-10與transcutol（2∶1）混合后的HLB值為12.22，與油相檸檬酸三乙酯所需的HLB值12.3最接近，因此該混合乳化劑的乳化效果較好，且與偽三元相圖篩選結果相符，故最終確定處方組成為檸檬酸三乙酯、乳化劑OP-10和transcutol。

一般情況下，自微乳的星點設計-響應面優化選擇粒徑及溶解度作為考察指標。本研究測得各處方制備的微乳粒徑介于7.64～11.65 nm之間。不同處方自微乳由于油相、乳化劑、助乳化劑的比例不同，形成的微乳粒徑存在差異，但是各處方的微乳粒徑均已很小，因此，粒徑不作為處方優化的考察指標。此外，實驗中還測定了各處方制備的微乳的Zeta電位，在?12.21～0.018 mV范圍，可見處方中油相、乳化劑、助乳化劑的比例不同，微乳的Zeta電位存在一定差異。自微乳給藥系統的質量評價不僅包括粒徑及分布、藥物質量濃度，也應包括穩定性考察。因此，本文對FF-SMEDDS進行了離心穩定性以及不同溫度條件下的穩定性考察，結果顯示，體系具有良好的離心穩定性，且在4、30℃條件下30 d內均保持穩定。

綜上所述，將氟苯尼考設計成自微乳給藥系統是可行的，可制得藥物質量濃度較高、粒徑分布均勻、體系穩定的氟苯尼考自微乳給藥系統。