雙黃連吸入溶液UPLC指紋圖譜及含量測定研究

尹睿卓 1,3，胡杰 2，王慧陽 1,3，周舟 1,3，馬新稱 1,3，鄧遠鋒 1,3，王雪花 1,3，李翠

[1.盈科瑞（橫琴）藥物研究院有限公司，廣東珠海 519000；2.北京盈科瑞創新醫藥股份有限公司，北京 10000；3.廣東省霧化吸入制劑工程技術研究中心，廣東珠海 519000；4.暨南大學，廣東廣州 510632]

雙黃連吸入溶液由我國已上市的雙黃連注射液的基礎上改良開發而成，含金銀花、黃芩、連翹3味中藥。雙黃連制劑臨床應用廣泛，具有疏風解表、清熱解毒之功效，可用于治療病毒及細菌感染所致的感冒、發熱、咳嗽等疾病，并對新型冠狀病有一定潛在的治療作用[1-4]。

雙黃連吸入溶液采用霧化吸入方式給藥，可通過吸入給藥途徑而增加呼吸道的藥物濃度和藥效維持時間，從而提高其療效，吸入給藥使藥物進入全身血循環的藥物濃度大幅度降低，可較大程度的避免注射劑因為靜脈給藥而造成的嚴重不良反應，降低了相對于注射劑的安全性擔憂[5-6]。

目前，雙黃連吸入溶液處于臨床前研究階段，本研究首次采用超高效液相-雙波長檢測法建立了雙黃連吸入溶液中酚酸、黃酮、木脂素、苯乙醇苷類成分的指紋圖譜，確定了17個共有指紋峰；并對綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸及連翹苷的含量進行測定。該方法相對全面地反映了雙黃連吸入溶液中藥效組分的種類、數量及含量特征。

1 儀器與試藥

安捷倫1290 InfinityⅡ超高液相液相色譜儀：配備二極管陣列檢測器，Open-LAB工作站（美國安捷倫公司）；SQP型（十萬分之一）電子分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；Master-s15型純水機（上海和泰儀器有限公司）。

雙黃連吸入溶液，批號：CP-200527-02（S2）、CP-200707-02（S3）、CP-200715-01（S4）、CP-200716-01（S5）、CP-200717-01（S6）、CP-200722-07（S7）、CP-201025-01（S8）、CP-201210-01（S9）、CP-201210-02（S10）、CP-201210-03（S11），由盈科瑞（橫琴）藥物研究院生產。新綠原酸對照品（批號：DST200521-015，質量分數：97.6%）、隱綠原酸對照品（批號：DST200521-035，質量分數：97.5%）購自成都樂美天醫藥德思特生物有限公司。異綠原酸B對照品（批號：000319-201912，質量分數：98.3%）購自江西佰草源生物有限公司。綠原酸對照品（批號：110753-201817，質量分數：96.8%）、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸對照品（批號：111782-201807，質量分數：94.3%）、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸對照品（批號：111894-201102，質量分數：94.1%）、連翹苷對照品（批號：110821-201816，質量分數：95.1%）購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Welch Ultimate?UHPLC XB-C18（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；以乙腈為流動相A，以0.4%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～1 min，7%～10%A；1～3.5 min，10%～11%A；3.5～5 min，11%～14%A；5～10 min，14%～15%A；10～16 min，15%～17%A；16～19 min，17%～25%A；19～30 min，25%A）；指紋圖譜及連翹苷測定檢測波長為210 nm，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸測定檢測波長為324 nm；柱溫為30℃；流速為0.3 mL/min；進樣量為2μL。

2.2 對照品溶液的制備

取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，搖勻，即得，作為指紋圖譜用對照品溶液。取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、連翹苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含新綠原酸15μg、綠原酸12μg、隱綠原酸12μg、異綠原酸B6μg、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸3μg、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸6μg、連翹苷15μg的混合對照品溶液，搖勻，即得，作為含量測定用混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品1 mL，置50 mL量瓶中，加50%（體積分數，下同）甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液（S8），按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件連續進樣6次，以黃芩苷為參照物，計算各共有峰的相對保留時間RSD值均小于5%，相對峰面積RSD值均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取同一批樣品6份（S8），按“2.3”項制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定，以黃芩苷為參照物，計算各共有峰的相對保留時間RSD值均小于5%，相對峰面積RSD值均小于5%，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液（S8），按“2.3”項方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、16、24、36 h按“2.1”項色譜條件測定，以黃芩苷為參照物，計算各共有峰的相對保留時間RSD值均小于5%，相對峰面積RSD值均小于5%，表明供試品溶液在36 h內穩定性良好。

2.4.4 指紋圖譜的建立及共有峰的標定 取10批雙黃連吸入溶液，按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，將10批雙黃連吸入溶液色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版”進行分析，采用中位數法（設置時間窗口寬度為0.1）對色譜峰進行自動匹配，形成共有模式圖，生成對照指紋圖譜（編號R），共得到17個共有峰，指紋圖譜疊加圖見圖1，對照指紋圖譜見圖2；相似度均大于0.90，符合相關要求，見表1。

表1 10批雙黃連吸入溶液指紋圖譜相似度比較結果Table 1 Results of similarity tests of 10 batches of Shuang‐huanglian solution for inhalation

圖1 10批雙黃連吸入溶液UPLC指紋圖譜疊加圖Figure 1 UPLC fingerprints of 10 batches of Shuang‐huanglian solution for inhalation

2.5 7種活性成分質量濃度的測定

2.5.1 專屬性考察 分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各2μL，注入液相色譜儀進行測定，色譜圖見圖3。

圖3 混合對照品及供試品色譜圖Figure 3 The chromatograms of mixed reference and samples

2.5.2 線性范圍考察 精密吸取“2.2”項混合對照品溶液0.25、0.5、1、2、3、5、6μL注入液相色譜儀，按“2.1”項色譜條件測定，以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表2，表明各化合物在相應范圍內線性關系良好。

表2 7種成分的線性考察結果Table 2 The results of the linear relationship of seven components(n=2)

2.5.3 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液2μL，連續進樣6次，按“2.1”項色譜條件測定，結果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、連翹苷峰面積RSD值分別為0.58%、0.50%、0.52%、0.27%、0.15%、0.10%、0.34%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復性試驗 取“2.3”項下供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，結果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、連翹苷平均質量濃度分別為0.686 4、0.652 2、0.706 9、0.357 1、0.128 2、0.308 2、0.663 7 mg/mL，其RSD值分別為1.22%、1.26%、1.29%、1.17%、1.09%、1.16%、1.32%，表明方法重復性良好。

2.5.5 穩定性試驗 取“2.3”項下供試品溶液，分別在0、2、4、8、16、24、36 h按“2.1”項色譜條件測定，結果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、連翹苷峰面積RSD值分別為0.64%、0.20%、0.31%、0.25%、0.92%、0.43%、0.90%，表明供試品溶液在36 h內穩定性良好。

2.5.6 回收率試驗 精密量取取同一批樣品6份（S8），每份0.5 mL，精密加入一定質量濃度的混合對照品溶液適量，按“2.3”項制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件測定，結果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、連翹苷平均加樣回收率分別為97.08%、99.91%、100.9%、102.5%、93.96%、103.4%、100.7%，見表3，表明方法準確度良好。

表3 (續)

表3 7種成分的加樣回收率試驗結果Table 3 The recoveries of seven components in Shuanghuanglian solution for inhalation(n=6)

2.5.7 樣品測定 取10批雙黃連吸入溶液成品，按“2.3”項制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進行測定[7-9]。結果測得10批雙黃連吸入溶液中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、連翹苷平均質量濃度分別為0.76、0.65、0.69、0.31、0.10、0.27、0.67 mg/mL，結果見表4。

表4 10批雙黃連吸入溶液質量濃度測定結果Table 4 The determination results of 10 batchesof Shuanghuanglian solution for inhalation(n=2) ρ/（mg·mL-1）

3 討論

雙黃連吸入溶液含有金銀花、黃芩、連翹3味中藥，其中金銀花中的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸為酚酸類成分，連翹中連翹苷為木脂素類成分，均具有抗感染、抗菌、抗病毒等作用，故選作為含量測定指標[10-11]。黃芩中的黃芩苷為黃酮類成分，色譜峰響應值較大，分離度較好，故將黃芩苷作為指紋圖譜參照峰。

本研究考察了甲醇、50%甲醇、70%甲醇3種供試品溶媒，結果不同溶媒處理的樣品含量測定結果差異不大，但采用50%甲醇處理的供試品溶液的色譜峰峰形更好，故選取50%甲醇作為供試品溶媒。同時又考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.4%磷酸水、乙腈-0.4%磷酸水4種流動相，結果乙腈-0.4%磷酸流動相系統基線平穩且分離效果較好。

目前，雙黃連制劑中多采用260～350 nm波段作指紋圖譜檢測波長[12-15]，而連翹和金銀花中部分化合物在210 nm波長左右有較強末端吸收。本研究分別考察對比了210、230、250、310、324、350 nm檢測波長色譜圖，結果顯示210 nm波長下各色譜峰分離較好、信息量較多；連翹苷在210 nm波長下長色譜峰響應值較大，專屬性與分離度較好，并可以與指紋圖譜測定相結合，故選擇210 nm作為指紋圖譜及連翹苷含量的檢測波長；324 nm波長下新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸響應值最大，各色譜峰分離較好，故選擇324 nm作為酚酸類成分的檢測波長。

本研究建立了雙黃連吸入溶液210 nm波長下的UPLC指紋圖譜，并采用雙波長檢測法對新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、連翹苷7種成分的質量濃度進行同時測定，該方法節省了分析時間并保證采集信息量的最大化，可為雙黃連吸入溶液的質量控制及后續藥效學評價提供參考。