隨機(jī)森林法篩選新生兒社區(qū)感染甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌耐藥和分子特征

徐少林 1，董茜 ，劉燕玲 ，李文輝 ，傅錦堅(jiān) 1，葉小華

（1.柳州市婦幼保健院檢驗(yàn)科/預(yù)防保健科，廣西柳州 545001；2.廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州 510310）

金黃色葡萄球菌（簡稱金葡菌）是引起新生兒細(xì)菌性感染的主要病原菌之一[1]。而隨著抗菌藥物的廣泛使用，導(dǎo)致具有高致病性和多重耐藥性的耐甲氧西林金葡菌（methicillin-resistantS.aureus,MRSA）感染的增加，使治療效果下降，治療難度進(jìn)一步加大[2]。值得重視的是，新生兒免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善，其機(jī)體處于易感狀態(tài)，極易受到病原菌（特別是高致病性、高耐藥性的金葡菌和MRSA）侵襲，從而導(dǎo)致皮膚軟組織感染、肺炎，甚至引起敗血癥、心內(nèi)膜炎等嚴(yán)重感染疾病。同時(shí)，新生兒處于生長發(fā)育的重要時(shí)期，其抗生素的臨床用藥非常有限。因此，加強(qiáng)新生兒金葡菌感染菌株的耐藥性及致病力監(jiān)測，及時(shí)掌握其耐藥譜，對(duì)臨床合理使用抗菌藥物和控制流行傳播至關(guān)重要。目前國內(nèi)外研究主要局限于研究新生兒MRSA感染菌株[3-5]，但是對(duì)MRSA菌株的特異性的耐藥和分子特征至今仍未闡明，且缺乏同樣具有高致病性的甲氧西林敏感金葡菌（methicillin-susceptibleS.aureus,MSSA）的新生兒感染研究。因此，本研究對(duì)新生兒感染MRSA和MSSA菌株的耐藥性和分子特征進(jìn)行深入研究，探究MRSA相關(guān)的特異性耐藥和分子特征，為指導(dǎo)臨床預(yù)防和治療新生兒金葡菌感染提供重要的理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象為2014年4月至2017年5月在柳州市婦幼保健院就診的社區(qū)獲得性金葡菌感染的新生兒（年齡≤28 d）。根據(jù)發(fā)病時(shí)間將新生兒感染分為早發(fā)型(日齡1～7 d)和晚發(fā)型(日齡8～28 d)。收集患者的基本信息，包括性別、年齡、臨床癥狀、感染類型、抗生素使用情況等。本研究中所有患者監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意，且獲得柳州市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（NO:2018-085）。

1.2 菌株分離鑒定

菌株分離鑒定實(shí)驗(yàn)包括：甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基顯色反應(yīng)、革蘭染色、觸媒試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)及凝固酶試驗(yàn)，以上實(shí)驗(yàn)均為陽性者初步鑒定為金葡菌。采用PCR實(shí)驗(yàn)確認(rèn)金葡菌是否攜帶16Sr RNA、nuc、mecA基因[6]，均攜帶16Sr RNA和nuc基因的確認(rèn)為金葡菌；mecA陽性或頭孢西丁耐藥的金葡菌被鑒定為MRSA。

1.3 藥敏試驗(yàn)

參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2015版，對(duì)所有金葡菌進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)，包括β-內(nèi)酰胺類（青霉素、頭孢西?。?、大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素）、林可酰胺類（克林霉素）、四環(huán)素類（四環(huán)素）、葉酸代謝抑制劑（復(fù)方新諾明）、利福霉素類（利福平）、苯甲醇類（氯霉素）、氟喹諾酮類（環(huán)丙沙星）、氨基糖苷類（慶大霉素）、糖肽類（萬古霉素）和惡唑烷酮類（利奈唑胺）。多重耐藥（multidrug-resistant，MDR）是指對(duì)3類或3類以上的抗菌藥物不敏感。以金葡菌ATCC 29213作為對(duì)照菌株。

1.4 基因檢測

利用PCR實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)菌DNA中毒素基因，包括免疫侵入基因（scn、chp、sak）、腸毒素基因（sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、sej、sek、sel、sem、sen、seo、sep、seq、ser、seu）、溶血毒素基因（hla、hlb、hld）、中毒性休克綜合征毒素基因（tsst1）及殺白細(xì)胞毒素基因（pvl）[7-9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用STATA version 14.0，運(yùn)用χ2或Fisher確切概率法來確定MRSA和MSSA之間臨床特點(diǎn)、耐藥表型和分子特征的差異。同時(shí)，利用R i386 3.5.1 軟件，采用隨機(jī)森林法對(duì)特征變量（耐藥表型和分子特征）進(jìn)行重要性評(píng)分，通過計(jì)算平均不純度減少值（mean decrease gini，MDG），評(píng)定特征變量的重要性，從而得到MRSA相關(guān)的重要特征變量。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

共檢出92株新生兒金葡菌臨床感染菌株，其中29株（31.5%）MRSA，63株（68.5%）MSSA。標(biāo)本主要來源于痰液（59株，64.1%），其次是來自膿液（22株，23.9%）、血液（5株，5.4%）、其他來源（6株，6.5%）。人群主要以晚發(fā)型感染（84.8%）為主，男性52例(56.5%)。

2.2 新生兒金葡菌多重耐藥情況

92株新生兒金葡菌中有33株（35.9%）為多重耐藥金葡菌（MDRSA），其中9株MDRSA均對(duì)紅霉素、克林霉素及頭孢西丁耐藥，提示新生兒金葡菌的主要耐藥模式為紅霉素-克林霉素-頭孢西丁，具體見圖1。

圖1 新生兒金葡菌的抗生素耐藥譜Figure 1 Antibiotic resistance spectrum of S.aureus from neonates

2.3 比較MRSA和MSSA的臨床特點(diǎn)

結(jié)合相關(guān)臨床資料，晚期新生兒易發(fā)生金葡菌感染而就醫(yī)，感染金葡菌的新生兒多數(shù)引發(fā)肺炎（61.4%），少數(shù)發(fā)生敗血癥（5.4%）；大多數(shù)（59.8%）住院時(shí)間≤10 d，少數(shù)（8.7%）轉(zhuǎn)入ICU治療，且有少數(shù)新生兒（13.0%）入院前使用過抗生素。不同年齡組新生兒的MRSA比例不同，其中8～14 d新生兒的MRSA比例最高（52.0%），≤7 d新生兒的MRSA比例最低（14.3%），差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；感染MRSA的新生兒比感染MSSA的住院時(shí)間長，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 新生兒MRSA和MSSA的臨床特點(diǎn)比較Table1 Comparison of clinical characteristicsbetween MRSA and MSSA from neonates[n(%)]

2.4 MRSA與MSSA的耐藥情況比較

新生兒金葡感染菌株對(duì)青霉素（96.7%）的耐藥性最高；所有菌株對(duì)萬古霉素均敏感，大部分菌株對(duì)氯霉素和利奈唑胺敏感。新生兒MRSA菌株對(duì)青霉素和頭孢西丁耐藥率均高于90%。此外，MRSA對(duì)頭孢西丁、紅霉素、克林霉素及四環(huán)素耐藥率均明顯高于MSSA，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。MRSA的多重耐藥率明顯高于MSSA（79.3%vs 15.9%），差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 新生兒MRSA和MSSA的耐藥情況比較Table 2 Comparison of resistance between MRSA and MS‐SA from neonates[n(%)]

2.5 MRSA與MSSA的毒素基因攜帶情況比較

新生兒金葡菌攜帶的免疫侵入相關(guān)基因以sak（95.7%）為主；腸毒素基因攜帶率均低于25%；攜帶溶血毒素基因hla（97.8%）和hld（94.6%）的比例較高；菌株攜帶pvl（17.4%）和tsst1（26.1%）基因比例較高。MRSA與MSSA菌株對(duì)各類毒素基因攜帶率的比較發(fā)現(xiàn)，MRSA菌株的sek攜帶率明顯高于MS‐SA菌株（34.5%vs9.5%），且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MRSA菌株pvl攜帶率稍高于MSSA菌株（24.1%vs14.3%），但差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。

表3 新生兒MRSA和MSSA的毒素基因攜帶情況Table 3 Comparison of virulence carriage between MRSA and MSSA from neonates[n(%)]

2.6 篩選MRSA重要特征變量的隨機(jī)森林分析

采用隨機(jī)森林篩選MRSA相關(guān)的耐藥和分子特征，并對(duì)特征變量進(jìn)行重要性排序，分析結(jié)果表明，MRSA相關(guān)的前5位重要特征變量分別為紅霉素耐藥、克林霉素耐藥、四環(huán)素耐藥、攜帶sek基因、攜帶pvl基因，重要性評(píng)分見圖2。

圖2 MRSA菌株的耐藥和分子特征的重要性排序Figure 2 Importance ranking of drug resistance and molecular characteristics of MRSA strains

3 討論

新生兒易受到金葡菌侵入而發(fā)生感染，在治療新生兒金葡菌感染有限可選的抗生素中，應(yīng)謹(jǐn)慎用藥，避免細(xì)菌耐藥進(jìn)一步發(fā)展。本課題組對(duì)新生兒感染的金葡菌的耐藥性和分子特征進(jìn)行研究，共分離出92株新生兒金葡菌感染菌株，主要以晚發(fā)性為主，與既往研究一致，表明金葡菌主要引起新生兒晚發(fā)型感染[10]。92株新生兒感染金葡菌中，31.5%為MRSA，與無錫市兒童醫(yī)院新生兒感染金葡菌中MRSA比例相近（28.6%）[11]，但明顯低于既往研究中北京兒童醫(yī)院新生兒感染金葡菌中MRSA比例（64.5%）[10]。本研究顯示，感染MRSA的新生兒比感染MSSA的住院時(shí)間長，提示MRSA菌株具有多重耐藥性和高致病力的特點(diǎn)；8～14 d新生兒的MRSA比例最高（52.0%），提示2周內(nèi)新生兒是MRSA感染的重點(diǎn)人群。

近年來金葡菌的耐藥水平越來越高，多重耐藥情況也越來越嚴(yán)重。既往文獻(xiàn)可知，一般人群金葡菌感染菌株耐藥情況較新生兒嚴(yán)重，故針對(duì)新生兒抗生素的使用應(yīng)有別于一般人群[12-14]。本研究揭示，近一半新生兒金葡菌對(duì)紅霉素、克林霉素耐藥，僅小部分新生兒金葡菌對(duì)頭孢西丁和四環(huán)素耐藥。提示針對(duì)新生兒金葡菌感染而言，可將耐藥率較低的頭孢西丁和四環(huán)素作為經(jīng)驗(yàn)用藥，而耐藥性相對(duì)較高的紅霉素和克林霉素則需參考藥敏結(jié)果使用。同時(shí)新生兒金葡菌對(duì)復(fù)方新諾明、慶大霉素、利福平、環(huán)丙沙星、氯霉素及利奈唑胺均保持較高的敏感性，且所有菌株均對(duì)萬古霉素敏感。以上結(jié)果提示新生兒發(fā)生金葡菌嚴(yán)重感染時(shí)，氯霉素、利奈唑胺等藥物能達(dá)到較好的治療效果，萬古霉素可作為治療難治感染的最后一道防線。值得關(guān)注的是，本研究單因素分析提示，MRSA對(duì)頭孢西丁、紅霉素、克林霉素及四環(huán)素的耐藥率均明顯高于MSSA，且MRSA的多重耐藥率明顯高于MSSA；與既往研究結(jié)果相似[13,15]，提示MRSA的耐藥情況整體比MS‐SA嚴(yán)重，因此給新生兒MRSA感染的臨床治療帶來極大挑戰(zhàn)。由此可見，臨床應(yīng)控制抗菌藥物濫用情況，避免MRSA耐藥進(jìn)一步發(fā)展，應(yīng)根據(jù)新生兒感染菌株的耐藥譜進(jìn)行合理用藥治療。

MRSA菌株具有強(qiáng)致病性，毒素基因在菌株致病能力上發(fā)揮重要作用。值得關(guān)注的是，MRSA菌株致病相關(guān)的特異性毒素基因至今仍未闡明。最新研究表明，嬰幼兒腹瀉與金葡菌腸毒素有關(guān)[16]。本研究中新生兒金葡菌中各腸毒素基因攜帶率均低于25.0%，比其他年齡組金葡菌的腸毒素基因少[17]。但仍需注意的是，母乳中常有金葡菌，是新生兒金葡菌感染最重要的病原體之一，故有必要采取良好的衛(wèi)生習(xí)慣，以減少新生兒感染的風(fēng)險(xiǎn)[18]。本研究中tsst1的攜帶率為26.1%，明顯高于新生兒鼻定殖菌株（0.0%）[19]，提示tsst1可能與金葡菌感染、致病密切相關(guān)。本研究單因素分析提示，MRSA菌株中腸毒素sek基因攜帶率明顯高于MSSA菌株，其他毒素基因攜帶率差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與既往研究結(jié)果基本一致[19]。既往研究發(fā)現(xiàn)，MRSA菌株pvl基因的攜帶率明顯高于MSSA菌株[19-20]；本研究中MRSA菌株pvl基因的攜帶率稍高于MSSA菌株，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，今后可增加樣本含量進(jìn)一步研究確認(rèn)以上研究結(jié)果。同時(shí)，MRSA和MS‐SA菌株中大部分的毒素基因攜帶率均無差別，提示MSSA菌株也具有廣泛的毒素基因，其毒力和致病性不容忽視，因此也應(yīng)引起重視。

隨機(jī)森林法分析結(jié)果表明，紅霉素耐藥、克林霉素耐藥、四環(huán)素耐藥是MRSA相關(guān)的重要耐藥特征變量，也揭示了MRSA多重耐藥狀態(tài)可能與對(duì)這幾類抗生素耐藥密切相關(guān)；攜帶pvl基因和sek基因是MRSA相關(guān)的重要分子特征變量。

本研究采用單因素χ2分析和隨機(jī)森林相結(jié)合分析方法，深入比較MRSA和MSSA菌株的耐藥特征和分子特征，揭示MRSA相關(guān)的重要耐藥特征變量和分子特征變量，為今后深入探究MRSA相關(guān)的耐藥機(jī)制和致病能力提供重要理論基礎(chǔ)。