水解酶對杜仲葉黃酮提取的影響研究

◎陳書明

（1.三門峽職業技術學院食品園林學院；2.三門峽市生物技術重點實驗室，河南三門峽 472000）

杜仲（Eucommia ulmoides），是杜仲科落葉喬木，是我國特有的名貴中藥材[1]。2000多年以來，人們都是以杜仲皮入藥[2]，因受產量限制杜仲皮在市場上供不應求。研究證實杜仲葉與杜仲皮有相似功效，2005年，杜仲葉被載入《中華人民共和國藥典》,2018年納入藥食兩用物質管理。杜仲葉主要藥理作用為降血壓、降血脂、降血糖、抗炎抗病毒、抗疲勞、強筋健骨、抗衰老等[3]。杜仲葉中含有豐富的營養物質，包括：VB1、β-胡蘿卜素，17種游離氨基酸，鍺、硒等15種微量元素，大約10%—20%的蛋白質。杜仲葉還含有豐富的活性成分，包括黃酮類、多糖類及杜仲橡膠等。目前，人們對杜仲葉的開發利用進行了研究，并研制出一系列杜仲葉新產品，其中利用杜仲葉制成的杜仲茶受到了廣泛的歡迎[4]。常見的杜仲速溶茶提取方法有水提法和有機溶劑法。這兩種方法的缺陷分別是杜仲葉中的活性成分溶出有限和提取物中存在有機溶劑殘留[5]。

酶制劑作為生物制劑，具有天然、綠色、安全、無污染等特點，被廣泛應用于食品加工的各個領域。纖維素酶能將杜仲葉片的纖維素分解，提高營養成分和活性成分的溶出。另外，杜仲葉中的粗蛋白只有1%-2%是可溶于水的，常規提取方法蛋白質的溶出率低，外用蛋白酶能將杜仲葉中蛋白質解轉化為氨基酸，不僅可以提高杜仲葉及杜仲葉蛋白的利用價值，還可以提高和改善水浸出物品質。果膠酶主要作用于杜仲葉細胞壁中的果膠，通過果膠水解，從而破壞由蛋白質、茶多酚和果膠等碳水化合物物形成的懸浮顆粒的穩定體系，使得茶湯澄清。單寧酶可以水解單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和葡萄糖。可以防止單寧分子中含有的酚羥基在多酚氧化酶存在的條件下被氧化，生成具有顏色的鄰醌，這種物質會加深產品的色澤[6]。另外現有研究表明，添加外源單寧酶可以在一定程度上降低產品苦澀味，從而提高產品的鮮醇度[7]。目前，人們對單一酶制劑在杜仲葉提取中的作用進行了研究，但復合酶制劑對杜仲葉的作用效果鮮少報道。

本研究以杜仲葉為原料，通過水解酶提取杜仲葉內成分，以黃酮含量為指標來反映酶制劑在杜仲葉提取時的效果，以期獲得提取率高、品質好的杜仲葉浸出產品，為杜仲茶生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

杜仲葉，靈寶帥華牧業有限責任公司提供；蘆丁（純度≥95.0%），北京來萊寶技有限公司提供；中性蛋白酶（酶活≥40萬U/g）、果膠酶（酶活≥120萬U/g）、纖維素酶（酶活≥1萬U/g）、單寧酶（酶活≥10萬U/g），佳味源實業有限公司產品；其他化學試劑均為分析純或化學純。

1.2 儀器與設備

LH-08B連續流粉碎機，長沙市中勝制藥機械廠；HA-4數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市榮華儀器制器有限公司；UV-1100紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法與步驟

1.3.1 提取工藝流程

杜仲葉→干燥→粉碎→酶解浸提→過濾去渣→測定活性成分含量

1.3.2 操作要點

（1）7月份采摘杜仲葉片相關參照文獻晾曬3-4天后240℃殺青[7-8]；

（2）取經殺青處理的杜仲葉片，根據前期試驗結果粉碎成40-80目，然后迅速置于自封袋，在陰涼處遮光保存；

（3）以杜仲葉粉末質量計，蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、單寧酶用量均設0.05%、0.10%、0.15%、0.20%4個梯度。制成杜仲葉水比為1∶50的混合液，35℃、45℃、55℃水浴加熱30min以未加酶制劑的為對照，同時做3組平行試驗；

（4）水浴后的樣液加1.5倍沸水，趁熱減壓過濾；

1.3.3 黃酮含量測定參照相關文獻[8-9]

繪制標準曲線 精密稱取蘆丁標準品10mg，用60%的乙醇溶解，超聲波助溶，定容至100mL，及配置成100μg/mL的標準溶液。取標準溶 液0.50、0.75、1.00、1.30、1.50、1.80、2.00mL定容至10mL，400nm處分別測量其吸光度。以溶液的吸光度為縱坐標，黃酮的濃度為橫坐標作黃酮標準曲線圖，標準曲線見圖1。

圖1 黃酮的標準曲線圖

線性回歸得到計算公式為：y=0.225x（y為吸光度，x為濃度）R2=0.999。

1.4 正交試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上各取3個水平進行L9（34）正交設計試驗，正交設計因素和水平見表1。

表1 正交設計因素和水平

2 結果與分析

2.1 蛋白酶對黃酮量的影響

蛋白酶對黃酮含量影響見圖2。

圖2 蛋白酶添加量與黃酮含量之間關系

圖2顯示，各處理溫度條件下，隨著蛋白酶添加量的增加黃酮呈先升高后降低趨勢，添加同劑量的酶制劑，35℃條件下的黃酮含量均高于45℃、55℃，這說明35℃是蛋白酶的最佳使用溫度。由圖5可知，35℃條件下蛋白酶添加量0.15%時黃酮含量最大，為9.51mg/g。因此，蛋白酶的最佳使用條件是添加量0.15%、溫度35℃。

2.2 果膠酶對黃酮含量的影響

果膠酶對黃酮含量影響見圖3。

圖3 果膠酶添加量與黃酮含量之間關系

由圖3可知，各處理溫度條件下，隨著果膠酶添加量增加處理組黃酮含量呈先上升后降低趨勢，且均高于對照，說明適當的果膠酶添加是有利于黃酮浸出和擴散的。由圖3可知，果膠酶的最佳使用條件是添加量0.10%、溫度35℃。

2.3 纖維素酶對黃酮含量的影響

纖維素酶對黃酮含量的影響見圖4。

圖4 纖維素酶添加量與黃酮含量之間關系

由圖4可知，各處理溫度下，隨著纖維素酶添加量增加處理組黃酮含量呈先上升后降低趨勢，且溫度越高，同劑量酶制劑條件下黃酮含量越高，說明適當的提高溫度有利于黃酮的浸出。由圖8可知，纖維素酶的最佳使用條件是添加量0.15%、溫度55℃。

2.4 單寧酶對黃酮含量的影響

單寧酶對黃銅含量的影響見圖5。

圖5 單寧酶添加量與黃酮含量之間關系

圖5顯示，35℃、45℃條件下，處理組黃酮含量隨著單寧酶添加量增加呈先升高后降低趨勢；45℃條件下各處理組黃酮含量均低于對照組，說明此溫度下添加單寧酶對于黃酮浸出和擴散時不利的；由圖5可知，單寧酶的最佳使用條件是添加量為0.05%、溫度35℃。

2.5 復合酶制劑對杜仲葉黃酮提取效果的影響

由單因素處理結果可知：4個處理結果中最適溫度條件為35℃有3個，最適溫度為55℃的有1個，考慮到進經濟成本確定復合酶制劑的最佳使用溫度定為35℃。單因素試驗時發現，果膠酶處理后過濾難度非常大，因為酶制劑之間存在協同增效作用，氫正交試驗時單寧酶的最大添加量設定為0.05%。復合酶制劑處理結果如表2。

根據表2可知，影響黃酮含量的因素主次排序為：蛋白酶＞單寧酶＞纖維素酶＞果膠酶，蛋白酶對黃酮含量影響最大，其次是單寧酶。蛋白酶最佳添加量為0.15%，纖維素酶為0.15%，單寧酶為0.01%，果膠酶為0.05%。試驗過程中發現，使用復合酶制劑處理時，酶解后過濾難度比除果膠酶外的其他單一酶制劑大，但是比單一果膠酶難度要小很多。

表2 正交試驗結果

按照100g杜仲葉添加蛋白酶0.15g、果膠酶0.05g，纖維素酶0.15g、單寧酶0.01g進行驗證試驗，該復合酶制劑能提高杜仲葉成分的提取率。

3 結論

通過單因素試驗，查明復合酶制劑有利于杜仲葉黃酮的提取；通過正交試驗，確定在35℃條件下，酶制劑對提取效果影響的主次因素排序為：蛋白酶＞單寧酶＞纖維素酶＞果膠酶；添加蛋白酶0.15%、果膠酶0.05%，纖維素酶0.15%、單寧酶0.01%時，杜仲葉黃酮含量為9.69mg/g，高出對照組23.28%，實現了提高杜仲資源利用率的目的。