基于Wnt/β-catenin信號通路探討去毒附子湯對骨關節炎大鼠的軟骨保護作用

陳祖祥 葛彥志 周莉 王春雷 陳俊杰 童培建 單樂天 劉福存

1.浙江中醫藥大學第一臨床醫學院 杭州 310053 2.浙江省腫瘤醫院 3.海軍軍醫大學附屬長征醫院

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是骨關節炎（osteoarthritis，OA）的常見類型，是最常見的一種關節炎性疾病[1-4]，影響滑膜和關節，導致疼痛及關節僵硬，使患者日?；顒?、運動和工作受限，嚴重降低患者的生活質量[5]。KOA是一種多因素性疾病，累及整個關節，包括軟骨、骨和滑膜[6-7]?，F代醫學治療輕、中度KOA的方案主要有生活方式改變、運動療法以及藥物療法，藥物療法包括服用非甾體類抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDS）、 類固醇激素關節腔內注射、關節內粘彈性物質氨基葡萄糖補充療法[8-11]。以上療法各有其優缺點，NSAIDS因其胃腸道并發癥而限制了長期應用，而類固醇激素關節腔內注射及氨基葡萄糖補充療法在臨床上仍有爭議，因此當前尚未發現理想的治療方法，也無法針對KOA的病因進行治療。

中醫認為，KOA屬“骨痹”“歷節”范疇，乃風寒濕三氣痹阻關節所致[12-13]。張仲景在《傷寒雜病論》中應用大量篇幅闡述了風寒濕邪痹阻關節的傳變及治療，并確立了理法方藥。附子湯首見于《傷寒論·辨少陰病脈證并治》，主論陽虛有寒導致的關節疼痛，有云：“少陰病，身體痛，手足寒，骨節痛，脈沉者，附子湯主之?！鼻捌谘芯恐邪l現，去毒附子湯（detoxicated Fuzi decoction，FZT）中的君藥去毒附子具有抗炎鎮痛作用，并且可以調節關節軟骨代謝[14-15]，但是FZT治療KOA的作用機制尚不明確。既往國內外研究發現多種信號通路與KOA發生密切相關，其中包括Wnt/β-連環蛋白 （Wnt/β-catenin）信號通路和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路等[16]。Wnt/β-catenin信號通路的異常激活能顯著減少軟骨細胞外基質分泌，抑制軟骨細胞分化[17]。因此本研究擬從Wnt/β-catenin信號通路切入，通過構建KOA大鼠模型，并且采用血清藥理學、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、實時定量聚合酶鏈式反應（Real-time quantitativepolymerase chain reaction，Real time-qPCR）及Western blot等方法，初步探索FZT治療KOA的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雌性無特殊病原體（specific pathogen free，SPF）級SD大鼠40只，8周齡，體質量（180±20）g，購于上海西普爾必凱實驗動物有限公司[實驗動物生產許可證號碼：SCXK（滬）2018-0006]，飼養于浙江中醫藥大學實驗動物中心全封閉SPF環境中 [實驗動物使用許可證號碼：SYXK（浙）2018-0012]。 室溫25℃，相對濕度40%～60%，每日光照12h，自由攝食和飲水。本研究經過浙江中醫藥大學動物倫理審查 （決議編號：ZSLL-2017-091）。

1.2 主要試劑 Trizol、逆轉錄試劑盒購于Takara公司（批號：AHF1813A、AI40832A）；SYBR Green購于Bimake公司（批號：B21202）；碘乙酸（monoiodoacetate，MIA）購于Sigma-Aldrich公司（批號：I4386）；β-actin、Wnt、糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β） 和β-catenin抗體購于Cell Signaling Technology公司（批號：#3700S、#2721、#5676、#8480）；卷曲關聯蛋白（frizzled-related protein，FRZB）抗體購于Abcam公司（批號：ab205284）；低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（low density lipoprotein receptor related proteins 5/6，LRP5/6） 抗體購于Novusbiologicals公司（批號：NBP1-45687）；番紅O-固綠（safranine O-fast green，SO）染色液購于Sigma公司（批號：HT90432）；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA）購于Solarbio公司（批號：E8030）。

1.3 主要儀器 ScopeA1型光學顯微鏡購于德國ZEISS公司；37370足底熱輻射測痛儀購于意大利UGO BASILE公司；YLS-3E電子壓痛測定儀為安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司產品；SW-CJ-1F層流超凈工作臺購于蘇州安泰空氣技術有限公司；100μm細胞篩、CO2細胞培養箱均為美國Thermo公司產品。

1.4 方法

1.4.1 FZT的制備 全方由去毒附子12g、茯苓9g、人參6g、白術12g、白芍9g等藥組成，上述飲片均由浙江中醫藥大學中藥飲片廠提供。先按前期方法制備去毒附子提取物[14-15]，將濃縮的去毒附子提取液加入其他藥材，加入約10倍量水，提取2次，每次0.5h，減壓濃縮成含有生藥2g·mL-1的藥液。根據等效劑量系數折算法計算藥品稀釋濃度[18]，得到FZT終濃度為：低劑量2.4g·kg-1，中劑量4.8g·kg-1（相當于臨床用藥劑量），高劑量9.6g·kg-1。

1.4.2 FZT含藥血清的制備 選擇10只SD大鼠隨機分為空白血清組和FZT含藥血清組，每組5只。FZT含藥血清組給予中劑量FZT灌胃，空白血清組給予相同劑量的0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天灌胃2次，連續7d。于末次灌胃2h后，大鼠腹腔注射麻醉，無菌條件下心臟采血，4℃保存2h后，3 000r/min離心10min，取上層血清，56℃水浴滅活，以0.22μm微孔濾膜濾過除菌，-80℃保存備用。

1.4.3 動物處理

1.4.3.1 分組與造模 將其余30只大鼠隨機分為正常組，模型組，FZT低、中、高劑量組，每組6只。除正常組外，其他各組采用關節腔注射MIA的方法造模，以3%戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，剃去膝關節局部被毛，消毒后固定大鼠并屈曲膝關節，將濃度為40mg·mL-1的MIA 50μL微量注射至關節腔內。

1.4.3.2 干預方法 MIA注射1周后進行疼痛行為學檢測，造模后的大鼠疼痛閾值顯著降低即造模成功[19]。造模成功后開始灌胃給藥，FZT低、中、高劑量組分別以2.4、4.8、9.6g·kg-1FZT灌胃，模型組和正常組以同劑量的0.9%氯化鈉溶液灌胃，均為1次/d，連續4周。

1.4.4 疼痛行為學檢測 首次給藥前和末次給藥后，對各組大鼠進行疼痛行為學檢測。

1.4.4.1 壓痛檢測 固定待測大鼠，放松其腿部，采用電子壓痛測定儀的感應探針刺壓大鼠足趾區域，待一定壓力下大鼠出現掙扎抬腿，暫停刺壓并記錄壓力強度。重復檢測3次后取平均值，為壓痛閾值。

1.4.4.2 熱痛檢測 將待測大鼠置于獨立小室中，使其自由活動直至安靜狀態，而后啟動底部的加熱儀，觀察大鼠足部動作，一旦足部收縮立即停止，記錄反應時間。重復檢測3次后取平均值，為熱痛閾值。

1.4.5 原代軟骨細胞分離培養 將3周齡左右的SD大鼠處死，無菌條件下剪取雙側股骨頭及膝關節，以75%乙醇充分浸泡，剔除關節周圍的肌肉和肌腱組織，打開關節腔，削取軟骨組織塊，置入無菌培養皿。加入磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffer saline，PBS）充分漂洗，進而將軟骨塊剪碎至lmm3大小，濾干后置入盛有0.2%的Ⅱ型膠原酶的廣口瓶中，于37℃恒溫震蕩箱中消化，40min后將上層消化液轉移至15mL離心管中，800r/min離心5min，收集底部細胞，再加入含10%胎牛血清的杜爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）制成細胞懸液，過濾后計數。 調整細胞密度為2×105個·mL-1，置于CO2細胞培養箱中培養。

1.4.6 組織病理學觀察 末次給藥后1周，過量麻醉處死各組大鼠，剪取膝關節并剔除多余肌肉組織，浸入甲醛溶液中固定。1周后取出，用水沖洗干凈，再以EDTA制備的脫鈣液進行脫鈣。待關節組織變軟后，依次完成脫水、包埋、切片和SO染色，光鏡下觀察，并分別參照Mankin評分標準[20]進行評分：（1）形態評分：形態正常為0分，表面不規則為1分，關節出現血管翳為2分，關節出現血管翳和軟骨表面不規則為3分，軟骨表面存在裂隙為4分，軟骨深部存在裂隙為5分，鈣化帶存在裂隙為6分；（2）軟骨細胞評分：軟骨細胞形態和數量正常為0分，彌漫性軟骨細胞增多為1分，局部軟骨細胞增多為2分，軟骨細胞過少為3分；（3）軟骨基質染色評分：染色區域正常為0分，染色區域輕度減少為1分，染色區域中度減少為2分，染色區域重度減少為3分，病理切片未著色為4分；（4）潮線完整性評分：潮線完整為0分，潮線被血管破壞為1分。評分總分為0～14分，由2人以上進行雙盲評分。

1.4.7 MTT檢測FZT對軟骨細胞增殖活力的影響 將軟骨細胞以4×105個·mL-1的密度接種于96孔板中，每孔加入Iscove改良的杜爾伯克培養基（Iscove's modified Dulbecco's medium，IMDM）100μL，貼壁培養24h后移除培養基，將細胞分為空白組、MIA組、干預組，其中空白組加入空白培養基100μL，MIA組加入MIA100μL，干預組在MIA組基礎上加入不同濃度的FZT含藥血清 （2.5%、5%、10%、15%、20%），分別培養24、48、72h。 每個時間點向每孔中加入MTT溶液10μL，37℃孵育4h后再加入二甲基亞砜150μL，酶標儀上檢測450nm吸光度（absorbance 450，A450），重復操作3次。

1.4.8 Real-time qPCR檢測相關mRNA的表達 將軟骨細胞分為NC組、TNF-α組、TNF-α+FZT組。其中，TNF-α組、TNF-α+FZT組均采用10ng·mL-1的TNF-α預處理6h，TNF-α+FZT組使用10%的FZT含藥血清處理24h，其余兩組使用空白培養基處理24h。各組細胞處理完成后加入氯仿劇烈振蕩，靜置5min后12 000r/min離心15min，取上清液并加入等量異丙醇，混勻后靜置10min，再以12 000r/min離心10min，去上清液，75%乙醇清洗，干燥沉淀后，加入RNase-free水溶解，提取總RNA。使用All-in-one cDNA反轉錄試劑盒合成cDNA，再用SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒檢測軟骨2型膠原（collgen type 2，Col2）、10型膠原（collgen type 10，Col10）、 基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP13）、帶有血小板凝血酶敏感蛋白結構域的解聚素與金屬蛋白酶4（adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4，Adamts4）、帶有血小板凝血酶敏感蛋白結構域的解聚素與金屬蛋白酶5（adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs5，Adamts5），Wnt/β -catenin信號通路相關因子FRZB、Wnt、LRP5/6、GSK-3β、β-catenin的mRNA表達，以2-ΔΔCt計算結果表示各目的基因相對表達量。引物由生工生物工程 （上海）股份有限公司合成。見表1。反應總體系為20μL，反應條件為：95℃變性5min，循環重復95℃變性10s，60℃退火和延伸30s，共40個循環。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4.9 Western blot檢測相關蛋白的表達 細胞分組和處理同1.4.8。收集細胞，去掉培養基，以PBS洗滌2次后加入細胞裂解液，冰上裂解30min，超聲破碎15s，離心收集上清液，以聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）試劑盒檢測蛋白濃度，取等濃度樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresi，SDS-PAGE），轉膜后封閉2h，洗膜后分別加入Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β和β-catenin一抗 （稀釋比例：1:1 000），4℃過夜，洗膜后加入二抗（稀釋比例：1:10 000），化學發光試劑（electrochemiluminescence，ECL）顯色與定影。

1.5 統計學分析 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示。組間總體比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）檢驗，兩兩比較均采用students-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠疼痛行為學結果比較 各組間總體比較，大鼠的熱痛閾值和壓痛閾值差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.01）。 與正常組比較，模型組大鼠的熱痛閾值和壓痛閾值顯著降低（P＜0.01，P＜0.01）；FZT灌胃干預后，FZT低、中、高劑量組大鼠的熱痛閾值和壓痛閾值較模型組顯著提高 （均P＜0.01），并靠近正常水平。見圖1及表2、3。上述結果表明，FZT低、中、高劑量對MIA造成的KOA關節疼痛有顯著緩解作用。

表2 各組大鼠壓痛閾值比較（±s，g）Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold in each group（±s，g）

表2 各組大鼠壓痛閾值比較（±s，g）Tab.2 Comparison of mechanical withdrawal threshold in each group（±s，g）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01Note:Compared with normal group，##P＜0.01;compared with model group，**P＜0.01

組別n 造模后第4周正常組 6 267.61±33.57模型組 6 132.89±26.61##FZT 低劑量組 6 224.33±13.31**FZT 中劑量組 6 241.20±29.80**FZT 高劑量組 6 259.40±21.20**

表3 各組大鼠熱痛閾值比較（±s，s）Tab.3 Comparison of thermal withdrawal latency in each group（±s，s）

表3 各組大鼠熱痛閾值比較（±s，s）Tab.3 Comparison of thermal withdrawal latency in each group（±s，s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01Note:Compared with normal group，##P＜0.01;compared with model group，**P＜0.01

組別n 造模后第4周正常組 6 11.50±1.27模型組 6 4.83±1.05##FZT 低劑量組 6 8.07±1.35**FZT 中劑量組 6 9.91±1.20**FZT 高劑量組 6 10.90±1.00**

圖1 各組大鼠疼痛行為學結果比較Fig.1 Comparison of pain-related behavioral results in each group

2.2 各組大鼠KOA的組織病理學結果比較 SO染色提示，正常組大鼠關節軟骨表面光滑、形態完整，基質內細胞排列整齊、分布區域均勻、層次清晰，未見軟骨細胞肥大性退變，軟骨下骨小梁區域正常，無斷裂或減少。模型組大鼠關節軟骨出現明顯缺損和形態破壞，隨處可見降解的軟骨基質，軟骨細胞大量丟失，可見典型的肥大性退變。FZT各劑量組中，關節軟骨改善明顯，FZT低劑量組關節存在少量軟骨細胞，但仍有肥大化趨勢，較模型組改善明顯；FZT中劑量組關節軟骨可見許多正常形態軟骨細胞，軟骨基質逐漸恢復正常；FZT高劑量組關節軟骨基本恢復正常，可見大量正常形態軟骨細胞，軟骨基質染色充分。見圖2。Mankin病理評分表明，模型組較正常組顯著增高（P＜0.01），FZT各劑量組評分較模型組顯著降低（均P＜0.01）。見圖3。

圖2 各組大鼠關節組織病理學觀察（SO染色，100×）Fig.2 Histopathological observation of rat joints in each group（SO staining，100×）

圖3 各組大鼠關節組織Mankin評分比較Fig.3 Comparison of Mankin's scoring of rat joints in each group

2.3 各組軟骨細胞增殖活力比較 MTT結果提示，加入FZT含藥血清共培養24、48和72h后，大鼠軟骨細胞增殖活力顯著增強，濃度從2.5%增加至20%，促增殖作用明顯增強，差異有統計學意義（P＜0.05）。作用24h和48h后，10%的FZT含藥血清促增殖作用最強，隨著濃度增加，促增殖作用趨于平穩。見表4。因此本研究后續實驗采用10%的FZT含藥血清進行干預。

表4 各組大鼠軟骨細胞增殖活力比較（%，±s）Tab.4 Comparison of proliferative activity in each group（%，±s）

表4 各組大鼠軟骨細胞增殖活力比較（%，±s）Tab.4 Comparison of proliferative activity in each group（%，±s）

注：與同時點2.5%含藥血清比較，◆P＜0.05；與同時點5%含藥血清比較，◇P＜0.05Note:Compared with 2.5% drug-containing serum at the same time，◆P＜0.05;compared with 5% drug containing serum at the same time，◇P＜0.05

含藥血清濃度 給藥后24h 給藥后48h 給藥后72h 2.5% 4.97±4.55 3.38±3.31 7.60±2.90 5% 11.32±3.70◆ 8.57±2.49◆ 15.31±4.01◆10% 19.48±5.01◆◇ 12.57±3.49◆◇ 23.60±3.02◆◇15% 19.40±6.60◆◇ 12.43±2.72◆◇ 27.70±6.92◆◇20% 19.24±4.03◆◇ 11.30±4.07◆◇ 27.91±2.91◆◇

2.4 各組大鼠軟骨細胞Wnt/β-catenin信號通路相關基因表達比較 與NC組比較，TNF-α組軟骨細胞Col10、MMP13、Adamts4、Adamts5、Wnt、LRP5/6、GSK-3β以及β-catenin顯著上調，而Col2顯著下調（均P＜0.01）；經10%的FZT含藥血清干預后，上述基因的mRNA表達變化均被顯著逆轉（均P＜0.01），而軟骨細胞FRZB的mRNA表達略有下降，但差異無統計學意義（P＞0.05）。 見圖4。

圖4 各組細胞Col2、Col10、MMP13、Adamts4、Adamts5、FRZB、Wnt、LRP5/6、GSK-3β、β-catenin的mRNA表達比較Fig.4 Comparison of mRNA expression of Col2，Col10，MMP13，Adamts4，Adamts5，FRZB，Wnt，LRP5/6，GSK-3β and β-catenin in each group

2.5 各組大鼠軟骨細胞Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達比較 與NC組比較，TNF-α引起軟骨細胞Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β和β-catenin的蛋白表達水平顯著上調（均P＜0.01）；經FZT含藥血清干預后，上述蛋白表達均顯著下調（均P＜0.01）。見圖5。

圖5 各組細胞Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β和β-catenin蛋白表達比較Fig.5 Comparison of protein expression of Wnt，LRP5/6，FRZB，GSK-3β and β-catenin in each group

3 討論

0A是以關節軟骨變性、破壞，滑膜炎癥，骨贅形成和軟骨下骨硬化為基本病理改變的疾病，主要臨床表現為慢性關節疼痛、關節僵硬、腫脹、畸形、活動受限等。在世界范圍內的所有成人關節病中，膝關節已經成為OA最好發的部位[21]。研究提示，一生中罹患KOA的概率是14%，45歲以上的人群中40%患有不同程度的OA[4]。隨著人口的老齡化趨勢的上升和肥胖率的增加，可以預料，如果KOA的治療水平不能夠得到相應的提升，那么KOA將對醫療系統和社會經濟造成沉重的負擔[4]。由于相關發病機制尚不清楚，因此目前臨床上對于KOA的治療手段非常有限。

近來研究表明，多種信號通路與KOA的發生密切相關，其中包括Wnt/β-catenin信號通路和TGF-β信號通路等。在大多數關節炎中都存在Wnt/β-catenin信號通路異常激活，Wnt/β-catenin信號通路可能參與了關節組織中軟骨細胞、成骨細胞和滑膜細胞的功能調控[22]。在Wnt/β-catenin經典信號通路中，分泌型的配體蛋白Wnt與膜表面受體蛋白FRZB結合后，激活胞內蓬亂蛋白（dishevelled，DVL）[23]。DVL通過抑制GSK-3β等蛋白形成的β-catenin降解復合物的活性，從而可以穩定細胞質中游離狀態β-catenin蛋白的水平。細胞質中穩定積累的β-catenin進入細胞核后，與T細胞因子淋巴樣增強因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）轉錄因子家族結合，啟動下游靶基因如原癌基因c-myc、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）等的轉錄[24]。Wnt-7a通過抑制2型膠原蛋白和蛋白聚糖的合成，能夠促使關節軟骨去分化，并且抑制其凋亡[16]；Wnt-5a和Wnt-5b通過對Cyclin D1和p130的調節，能夠促進軟骨細胞增殖，而推遲其分化[17]。βcatenin在成骨細胞中廣泛表達，可與關節形成必需的轉錄因子Y染色體性別決定區-盒轉錄因子9（sex-determing region of Y chromosome-box transcription factor 9，SOX9）相關聯，而SOX9的功能是抑制βcatenin的活性從而調節軟骨細胞分化[25]。Hill等[26]研究表明，β-catenin在成骨細胞前體中有自我修復功能，Wnt/β-catenin信號通路是防止成骨細胞向軟骨細胞分化所必需的。綜合以上研究的結果，筆者推測抑制Wnt/β-catenin信號通路可能是治療KOA的有效途徑。

祖國傳統醫學的認識中，OA屬于 “痹癥”“骨痹”范疇，其病因可分為內外兩端。《素問·痹論》曰“風寒濕三氣雜至，合而為痹”“痹者，重感于風寒濕之氣也”?！断ス顷P節炎中醫診療專家共識（2015年版）》將KOA主要證型歸納為：氣滯血瘀、寒濕痹阻、肝腎虧虛、氣血虛弱四個證型，其中又以寒濕痹阻證較為多見[27]。中醫學認為患者體質素虛，腠理空疏，營衛不固，風寒濕邪乘虛侵襲人體，導致氣血運行受阻，進而產生疼痛、腫脹、屈伸不利等一系列癥狀，是本病的根本病機[27]，所以針對KOA的中醫治療多以祛邪扶正為主。

中醫對附子湯的應用始于《傷寒論》，有云：“少陰病，身體痛，手足寒，骨節痛，脈沉者，附子湯主之?！狈街杏酶阶訙啬I以扶真陽之本，用人參大補元氣以扶后天之虛，加茯苓、白術健脾利水化濕，又以芍藥以制術、附之溫燥以護陰，且配苓、術助疏泄以利水。歷代醫家認為本方重在溫補元陽、以散寒濕，將其譽為“溫補第一方”。現代藥理學研究顯示，以上5味藥的藥理活性成分均具有鎮痛、抗炎等作用[28-32]。劉毅等[33]以附子湯從少陰辨證治療寒濕型類風濕關節炎80例，結果治愈7例、顯效25例、有效39例，總有效率為88.8%。由此證實，附子湯具有治療KOA的臨床應用價值。

疼痛是KOA患者的主要癥狀，減輕和消除疼痛是臨床治療的主要目標之一[34-35]。KOA疼痛的發病機制復雜，滑膜炎癥是其主要的原因[36]。滑膜炎癥是OA的重要特征，表現為滑膜增厚，滲出增多，導致關節腫脹，是造成炎性疼痛的主要成因[37]。在本研究中，采用MIA關節腔注射制備KOA大鼠模型，1周后疼痛行為學顯示模型組大鼠的壓痛和熱痛閾值較正常組顯著降低，這表明KOA大鼠模型成功建立。在此基礎上，進一步進行FZT干預。干預第4周后，FZT低、中、高劑量組大鼠的熱痛和壓痛閾值較模型組均顯著提高，提示FZT能提高KOA模型大鼠的疼痛閾值，而且作用效果可能與劑量有關，但是其具體機制仍需進一步探討。

軟骨損傷是OA最主要的病理改變。楊帆[38]研究表明，KOA兔模型的軟骨結構紊亂，層次不清，表層軟骨出現剝脫且表層細胞減少，局部軟骨細胞簇集，潮線消失。本研究中，模型組軟骨出現典型的KOA樣病變，FZT各劑量組軟骨雖有少量軟骨細胞肥大，但與模型組比較，均有一定程度的改善和修復。同時Mankin評分也說明FZT能夠改善軟骨退變的表現，而且其作用可能與劑量有關。

膠原酶誘導的Col2降解和蛋白聚糖酶誘導的聚集蛋白聚糖的降解是OA的早期病理標志[39]。MMP13作為主要的膠原酶，而Adamts4/5作為主要的聚集蛋白聚糖酶，在OA進展過程中能夠降解軟骨中的Col2和聚集蛋白聚糖[40-41]。Col10是OA中晚期軟骨細胞肥大標記物，OA由于軟骨細胞肥大和鈣化，導致Col10水平上調，與OA患者不同程度的軟骨退化和炎癥有關[42]。在OA的發展過程中，促炎細胞因子如TNF-α，通過激活軟骨細胞分解代謝參與軟骨降解，KOA患者滑液中TNF-α的濃度升高也已得到證實[43]。因此，本研究應用TNF-α處理的軟骨細胞作為KOA樣體外模型，并進行細胞和分子實驗，以評估FZT對KOA的治療機制。本研究結果證實，TNF-α可以上調Adamts4/5、MMP13、Col10的表達并下調COL2的表達，FZT含藥血清可以逆轉上述改變。進一步研究發現，TNF-α可以激活Wnt/β-catenin信號通路，破壞軟骨，促進降解；FZT含藥血清則可以降低Wnt、LRP5/6、GSK-3β和β-catenin的 mRNA表達和Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β和β-catenin蛋白的表達。FRZB在干預前后雖然mRNA水平沒有變化，但是在蛋白水平上則顯著改變，這可能是由于檢測時間點的不同，也可能是由于轉錄過程中的降解以及翻譯過程中的調控和修飾[44]，導致了mRNA和蛋白表達水平的差異，這些需要進一步研究。

綜上所述，FZT能有效改善KOA大鼠的疼痛癥狀，防止軟骨退化，其分子機制與Wnt/β-catenin信號通路有關。本研究為FZT治療KOA的臨床應用提供了科學依據，也為FZT的臨床安全應用和二次開發奠定了基礎。同時，由于KOA的發病機制復雜，涉及病變部位不止軟骨，還有滑膜與軟骨下骨等，所以需要進一步的研究來闡釋FZT治療KOA的機制，這對于了解KOA的發病機制和開發治療KOA的藥物具有重要意義。