過(guò)表達(dá)miR-182-5p對(duì)克羅恩病大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究

婁海芳 胡 娟 吳海翔

克羅恩病(CD)是一種慢性腸道非特異性炎性疾病，具有病情反復(fù)、并發(fā)癥多等特點(diǎn)[1]。若不及時(shí)控制CD患者病情，易并發(fā)腸瘺、腸穿孔及腸梗阻等，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[2]。研究顯示，37%～61%的CD患者在確診10年內(nèi)接受至少1次手術(shù)治療[3]。目前，關(guān)于CD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其發(fā)病與遺傳、免疫功能紊亂等有關(guān)，尚缺少有效的治療藥物[4]。因此，探究CD的發(fā)病機(jī)制對(duì)于其治療方案的選擇及靶向藥物研發(fā)均具有重要意義。

miRNA是一種由18～24個(gè)核苷酸組成的不具備編碼蛋白質(zhì)功能的單鏈RNA，可參與CD的發(fā)病及進(jìn)展過(guò)程。Yan等[5]研究表明，miR-21在CD患者中特異性表達(dá)，且與CD疾病活動(dòng)指數(shù)(CDAI)呈正相關(guān)。另有研究表明，miR-200和miR-125a也參與了CD的發(fā)病和進(jìn)展過(guò)程[6-7]。有報(bào)道指出，miR-182-5p可通過(guò)調(diào)控Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制炎性反應(yīng)[8]；而TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與CD有關(guān)[9-11]，推測(cè)miR-182-5p與CD存在聯(lián)系。本文探究了miR-182-5p的表達(dá)對(duì)克羅恩病(CD)大鼠的作用及機(jī)制，以期闡明miR-182-5p與CD的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究選取36只SPF級(jí)的SD大鼠，均購(gòu)自于南京拉姆達(dá)醫(yī)藥有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(蘇)2017-0040。大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間自由攝水、攝食，控制飼養(yǎng)溫度為25 ℃，濕度為60%，晝夜交替周期為12 h。

1.2 方法

1.2.1 CD大鼠模型構(gòu)建 從36只SD大鼠中隨機(jī)選取8只作為正常組，不予任何處理，其余28只給予TNBS/50%乙醇溶液灌腸處理(給藥劑量為150 mg/kg)構(gòu)建CD大鼠模型[12]。造模21 d后，隨機(jī)選取4只大鼠行H-E染色，驗(yàn)證是否造模成功。將造模成功的24只大鼠隨機(jī)分為3組：模型組、對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組，每組各8只。對(duì)照組給予尾靜脈注射5 μL含空載質(zhì)粒的慢病毒；過(guò)表達(dá)組給予尾靜脈注射5 μL含過(guò)表達(dá)miR-182-5p質(zhì)粒的慢病毒，每周注射1次，共注射2次。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢驗(yàn)miR-182-5p過(guò)表達(dá)是否成功。

1.2.2 CDAI評(píng)分 根據(jù)大鼠體質(zhì)量減失率、糞便性狀、糞便隱血及血便這3個(gè)維度計(jì)算CDAI評(píng)分。體質(zhì)量減失率分為0～4分：0分 體質(zhì)量減失率為0；1分 體質(zhì)量減失率為1%～4%；2分 體質(zhì)量減失率為5%～9%；3分 體質(zhì)量減失率為10%～14%；4分 體質(zhì)量減失率≥15%。糞便性狀分為0～4分：0分 糞便性狀正常；1分 糞便松散；2分 糞便松散程度增加，未達(dá)到稀便；3分 稀便；4分 稀便程度增加。糞便隱血及血便分為0～4分：0分 無(wú)隱血；1分 隱血陽(yáng)性；2分 隱血陽(yáng)性程度增加；3分 肉眼可見血便；4分 肉眼可見血便程度增加。CDAI評(píng)分為上述3項(xiàng)評(píng)分之和[13]。

1.2.3 H-E染色 在末次注射1周后處死大鼠，取位于橫結(jié)腸、距肛門1 cm處的腸組織，4%多聚甲醛固定，乙醇脫水，石蠟包埋，切片。脫蠟后滴加染料，然后乙醇脫水，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理變化。

1.2.4 炎性因子水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平。取實(shí)驗(yàn)1.2.3中大鼠心臟血液3 mL，3 000 r/min離心5 min，提取上層清液，分別置于IL-1β、IL-6和TNF-α檢測(cè)試劑盒(均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)中進(jìn)行反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀讀取吸光度值。

1.2.5 miR-182-5p表達(dá)水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-182-5p的表達(dá)水平[14]。取實(shí)驗(yàn)1.2.3中大鼠結(jié)腸組織，研磨成組織勻漿，使用TRIzol試劑(購(gòu)自日本TAKARA公司)提取組織勻漿中總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自日本TAKARA公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用PCR擴(kuò)增儀[(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]擴(kuò)增cDNA，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，之后95 ℃ 15 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt表示miR-182-5p的相對(duì)表達(dá)量。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)，序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6 TLR4和NF-κB表達(dá)水平檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)腸組織中TLR4和NF-κB的表達(dá)水平[15]。使用RIPA裂解液裂解結(jié)腸組織細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量；凝膠電泳，電壓由80 V增至120 V，直至溴酚藍(lán)跑出膠面，300 mA電流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；分別滴加兔抗鼠TLR4單克隆抗體、兔抗鼠NF-κB單克隆抗體和兔抗鼠β-actin單克隆抗體(均購(gòu)自臺(tái)灣亞諾法生技股份有限公司)，4 ℃孵化過(guò)夜；分別滴加山羊抗兔二抗[購(gòu)自安諾倫(北京)生物科技有限公司]，室溫孵育2 h；ELC發(fā)光液顯影。應(yīng)用ImageJ軟件讀取實(shí)驗(yàn)圖像并進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組CDAI比較

正常組、模型組、對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組的CDAI評(píng)分分別為(0.82±0.16)分、(3.57±0.25)分、(3.48±0.30)分和(2.01±0.45)分，4組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組CDAI評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組與對(duì)照組的CDAI評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組和對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組的CDAI評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化

H-E染色結(jié)果可知，正常組結(jié)腸組織中腺管結(jié)構(gòu)完整、清晰，杯狀細(xì)胞分布均勻，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組和對(duì)照組中腺管結(jié)構(gòu)模糊，黏膜層損傷嚴(yán)重，其中黏膜固有層有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；過(guò)表達(dá)組中腺管結(jié)構(gòu)較完整、清晰，杯狀細(xì)胞分布較均勻，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

2.3 各組miR-182-5p表達(dá)水平比較

正常組、模型組、對(duì)照組和過(guò)表達(dá)組的miR-182-5p的相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.11、0.26±0.05、0.26±0.06和1.54±0.10，4組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常組比較，模型組miR-182-5p的表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組與對(duì)照組的miR-182-5p表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組和對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組的miR-182-5p表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 各組大鼠結(jié)腸組織IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平比較

由表2可知，與正常組比較，模型組的IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。模型組與對(duì)照組的IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組和對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組的IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

圖1 各組結(jié)腸組織病理圖像 H-E染色 ×100 A 正常組 B 模型組 C 對(duì)照組 D 過(guò)表達(dá)組

表2 各組大鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平比較/ng·L-1

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織TLR4和NF-κB表達(dá)水平比較

由表3、圖2可知，與正常組比較，模型組的TLR4和NF-κB表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。模型組與對(duì)照組的TLR4和NF-κB表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組和對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組的TLR4和NF-κB表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4和NF-κB的相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織中TLR4和NF-κB的表達(dá) A 正常組 B 模型組 C 對(duì)照組 D 過(guò)表達(dá)組

3 討論

CD患者主要的臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、腹部包塊及膿血樣便等，其病理學(xué)變化主要為結(jié)腸組織炎性反應(yīng)[16]。本實(shí)驗(yàn)采用TNBS/50%乙醇溶液灌腸構(gòu)建CD大鼠模型，經(jīng)H-E染色觀察顯示，大鼠結(jié)腸組織腺管結(jié)構(gòu)模糊，黏膜層損傷嚴(yán)重，其中黏膜固有層有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明CD大鼠模型造模成功。此外，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-182-5p表達(dá)水平，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)組miR-182-5p表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，表明過(guò)表達(dá)miR-182-5p模型構(gòu)建成功。

CDAI評(píng)分可較為客觀地反映結(jié)腸損傷情況。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組的CDAI評(píng)分低于對(duì)照組，表明過(guò)表達(dá)miR-182-5p可減輕TNBS誘導(dǎo)的CD大鼠癥狀；此外，H-E染色結(jié)果也表明過(guò)表達(dá)組結(jié)腸組織的損傷程度輕于對(duì)照組，提示過(guò)表達(dá)miR-182-5p對(duì)CD大鼠有一定保護(hù)性作用。

IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平與炎性反應(yīng)關(guān)系密切，已被用于評(píng)價(jià)機(jī)體炎性反應(yīng)狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組的IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)水平均低于對(duì)照組，表明過(guò)表達(dá)miR-182-5p可降低CD大鼠結(jié)腸組織中炎性因子的表達(dá)水平。研究表明，TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可參與IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子的調(diào)節(jié)，與炎性疾病的關(guān)系密切[17]；此外，TLR4還可調(diào)節(jié)腸道黏膜的先天防御系統(tǒng)，可保護(hù)腸道黏膜，維持腸道微生態(tài)平衡[18]。另有多項(xiàng)研究表明，TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在CD中發(fā)揮著重要作用，可通過(guò)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子分泌而加重結(jié)腸組織炎性損傷[19-20]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組的TLR4和NF-κB表達(dá)水平均低于對(duì)照組，表明過(guò)表達(dá)miR-182-5p可抑制CD大鼠結(jié)腸組織中TLR4和NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其保護(hù)CD大鼠的作用。

綜上所述，過(guò)表達(dá)miR-182-5p對(duì)TNBS誘導(dǎo)的CD大鼠具有一定的保護(hù)性作用，可降低炎性因子表達(dá)水平，其機(jī)制可能與調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。本研究?jī)H探究了過(guò)表達(dá)miR-182-5p對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，下一步將驗(yàn)證其是否可通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與CD的發(fā)病及進(jìn)展。