應(yīng)用TLC-CMS技術(shù)檢測(cè)核桃青皮中醌類化合物

杜京旗，陳嬌嬌，楊衛(wèi)民

（呂梁林果植物化學(xué)省市共建山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地；山西省特色植物功能成分工程研究中心，呂梁學(xué)院，山西呂梁 033001）

核桃醌，又稱胡桃醌，化學(xué)名：5-羥基-1,4-萘醌（C10H6O）3，是從核桃樹(shù)皮、青龍衣或核桃殼等提取的具有極高藥用價(jià)值的萘醌類雜環(huán)化合物。其性質(zhì)不穩(wěn)定，溶劑對(duì)胡桃醌的穩(wěn)定性影響較大，隨著存放時(shí)間的加長(zhǎng)胡桃醌會(huì)分解[1]。核桃醌會(huì)抑制甚至殺死其他作物的生長(zhǎng)。因此，研制了以核桃醌為有效成分的殺蟲(chóng)劑和除草劑；胡桃醌是一種具有很高活性的化學(xué)物質(zhì)，對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，對(duì)某些植物有毒性作用[2]。青皮中含有含量較高的活性物質(zhì)胡桃醌（5-羥基-1,4-萘醌）。我國(guó)傳統(tǒng)中藥及臨床上有用核桃青皮來(lái)治療胃痛、胃潰瘍、皮膚病和子宮脫落等疾病的記載[3]。核桃醌明顯的抗腫瘤、抗菌、抗炎等藥理作用，也越來(lái)越受到醫(yī)藥界的關(guān)注[4-6]。多項(xiàng)研究表明，核桃青皮的抗腫瘤作用突出，開(kāi)發(fā)制成新的抗腫瘤藥物是今后的研究熱點(diǎn)；其提取液也可治療各種皮膚病，所以核桃青皮劑型及其療效也是今后研究的方向。另外，在保健型化妝品方面的應(yīng)用也有待于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)[7]；從中提取的天然色素化學(xué)和物理性質(zhì)穩(wěn)定，在制成食品著色添加劑和保健品方面也具有一定的開(kāi)發(fā)價(jià)值[8]；核桃青皮中含有很多農(nóng)藥活性成分，所以可以開(kāi)發(fā)出最新的生物肥料和生物農(nóng)藥。目前，針對(duì)該活性物質(zhì)的研究成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。因此，試驗(yàn)選用核桃青皮為原料，從中制備胡桃醌，并對(duì)其進(jìn)行表征，從而為核桃青皮中的胡桃醌進(jìn)一步研究和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

核桃青皮，呂梁本地。

1.1 胡桃醌提取方法

（1）粉碎過(guò)濾。將原料核桃青皮陰干再進(jìn)行粉碎，按照料液比1∶30加入75%的甲醇，置于氣浴恒溫振蕩器中振蕩12 h。超聲波微波萃取儀提取：將振蕩后的液體用超聲波微波萃取儀萃取，萃取分3個(gè)階段提取，每階段10 min，共30 min。在超聲波恒定的條件下，設(shè)置溫度為40，45，50℃；微波頻率為100，200，300 MHz；超聲波功率為850，900，800 W；模式15∶10，電機(jī)轉(zhuǎn)速900 r/min。離心或過(guò)濾：將提取液于轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，3次，合并上清液，獲取沉淀物與上清液，粗濾后用0.45μm微膜進(jìn)行減壓過(guò)濾，將沉淀物與濾渣合并。

（2）濃縮蒸發(fā)。倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的帶有標(biāo)準(zhǔn)磨口接口的圓底燒瓶，接口處涂抹凡士林，打開(kāi)冷凝管，設(shè)置水浴溫度為65℃（甲醇沸點(diǎn)64~65℃，由于溶液中有水，設(shè)置為65℃），進(jìn)行甲醇的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至冷凝時(shí)已無(wú)液體蒸發(fā)出來(lái)，大約為體積的1/10。將接收燒瓶中的甲醇回收起來(lái)進(jìn)行再利用。石油醚萃取：將上步獲得的上清液與石油醚按照1∶1的比例用分液漏斗萃取3次，取下相進(jìn)行收集。

（3） 酸化。將石油醚相用2%的鹽酸酸化至pH值2~3。氯仿萃取：將酸化后的石油醚相按照1∶1比例萃取3次，收集下相。濃縮蒸發(fā)：將氯仿相倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的圓底燒瓶，打開(kāi)冷凝管，設(shè)置水浴溫度為62℃（氯仿沸點(diǎn)61.3℃），將氯仿蒸發(fā)，直至冷凝時(shí)已無(wú)液體蒸發(fā)出來(lái)，燒瓶中的氯仿都蒸干。將接收燒瓶中的氯仿回收起來(lái)進(jìn)行再利用。

（4）烘箱干燥。設(shè)置溫度65℃，待其烘干至固體，取出坩堝放置至冷卻，稱量坩堝和固體的總質(zhì)量，并計(jì)算提取率。公式如下：

1.2 紫外檢測(cè)胡桃醌含量

確定醌類化合物的最大吸收波長(zhǎng)為412 nm左右。將胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品取0.4，0.8，1.0，1.2，1.4 mL于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，掃描最大吸收波長(zhǎng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品稀釋50倍，然后用紫外檢測(cè)其在412 nm處的吸光度值。再將得到的數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算樣品中醌類化合物的含量。

1.3 薄層層析色譜分離純化

（1） 點(diǎn)樣。先將硅膠板置于烘箱中活化0.5 h。用微量進(jìn)樣器緩慢吸取25μL胡桃醌對(duì)照品溶液，置于全自動(dòng)點(diǎn)樣機(jī)上，設(shè)置點(diǎn)樣參數(shù)（點(diǎn)樣間距10 mm，點(diǎn)樣寬度8 mm，點(diǎn)樣數(shù)目4，點(diǎn)樣量分別為3，3，3，3μL，點(diǎn)樣速度2 s/μL），在硅膠板上進(jìn)行點(diǎn)樣，在吸取25μL供試品溶液，點(diǎn)樣12μL。

（2）展開(kāi)。在層析缸中配制正己烷-乙酸乙酯-乙醇=8∶1∶1混合溶液作為胡桃醌的展開(kāi)劑蓋上蓋子搖晃混勻后等待20 min，待試劑蒸汽在展開(kāi)缸中飽和后，將點(diǎn)樣完成的硅膠板輕輕放入臥式展開(kāi)缸內(nèi)，注意展開(kāi)劑不能浸沒(méi)點(diǎn)樣斑點(diǎn)處，以防點(diǎn)樣物質(zhì)在展開(kāi)劑中溶解，待到展開(kāi)劑前沿距離硅膠板頂端1 cm處時(shí)，取出硅膠板晾干。

（3） 薄層色譜成像系統(tǒng)記錄。將晾干的層析板放入薄層色譜成像系統(tǒng)，在波長(zhǎng)365 nm的紫外光燈下拍照觀察層析情況，并拍照記錄。

1.4 紅外光譜儀檢測(cè)

將儀器和軟件打開(kāi)使其處于工作狀態(tài)，在測(cè)量每一個(gè)樣品之前，都需要用擦鏡紙擦干凈點(diǎn)樣中心處，先測(cè)量單通道背景光譜，然后將樣品用毛細(xì)管點(diǎn)樣至光學(xué)臺(tái)的金剛石上，再進(jìn)行單通道樣品光譜的測(cè)量。每一個(gè)樣品測(cè)量后，都需要進(jìn)行譜圖處理，例如進(jìn)行氣氛補(bǔ)償，可消除CO2、H2O的干擾。然后將檢測(cè)出來(lái)的光譜轉(zhuǎn)換成倒峰，選擇單峰檢索標(biāo)出每一個(gè)特征峰，保存并進(jìn)行分析。

1.5 質(zhì)譜儀檢測(cè)

（1）標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜檢測(cè)。用色譜甲醇和超純水作為流動(dòng)相。將儀器和軟件打開(kāi)使其處于工作狀態(tài)，用微量進(jìn)樣器吸取10μL的胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品溶液插入到進(jìn)樣口處，打到load檔開(kāi)始進(jìn)樣，進(jìn)完樣后打回到inject檔。點(diǎn)開(kāi)譜圖界面對(duì)譜圖進(jìn)行分析并保存。

（2）待測(cè)液的質(zhì)譜檢測(cè)。流動(dòng)相與測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的流動(dòng)相相同。使儀器和軟件處于工作狀態(tài)，將待測(cè)品薄層板置于TLC-質(zhì)譜接口上，使激光口對(duì)準(zhǔn)圈出的胡桃醌對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)中央處。用軟件操作進(jìn)行取樣，點(diǎn)開(kāi)譜圖界面對(duì)譜圖進(jìn)行分析并保存。

1.6 旋光儀檢測(cè)

測(cè)定比旋度、旋光度時(shí)，首先將自動(dòng)旋光儀調(diào)至模式2，測(cè)定其比旋度。然后設(shè)置參數(shù)，長(zhǎng)度為1.0，濃度為1.000，復(fù)測(cè)次數(shù)為3次，波長(zhǎng)為1（589.3 nm），開(kāi)始測(cè)定，得出3組數(shù)據(jù)求其平均值。再將自動(dòng)旋光儀的模式調(diào)成1，測(cè)定旋光度。設(shè)置參數(shù)，長(zhǎng)度為1.0，比旋度為測(cè)量平均值，復(fù)測(cè)次數(shù)為3次，波長(zhǎng)為1（589.3 nm），開(kāi)始測(cè)定，得出3組數(shù)據(jù)求其平均值。

1.7 熔點(diǎn)儀檢測(cè)

接通電源，將面板上電壓旋鈕調(diào)整到75 V（由手冊(cè)附圖查的胡桃醌已知熔溫所合適的電壓為75 V），升溫速率6℃/min。將醌類提取液倒入坩堝中，用電熱板進(jìn)行蒸發(fā)結(jié)晶，待提取液完全結(jié)晶后將其裝入裝樣毛細(xì)管中，高度約2~3 mm。然后開(kāi)啟電源開(kāi)關(guān)（照明燈應(yīng)亮）即可升溫。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡桃醌的含量

胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

紫外測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=26.38X+0.008，并且質(zhì)量濃度為0.006 144~0.030 720 mg/mL內(nèi)吸光度呈良好的線性關(guān)系R2=0.998。

將樣品稀釋50倍測(cè)其為412 nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度，測(cè)得為0.22，帶入回歸方程計(jì)算其質(zhì)量濃度為0.008 mg/mL，由此可得胡桃醌的含量為0.4 mg。

2.2 分離純化

核桃青皮薄層圖見(jiàn)圖2。

圖2 核桃青皮薄層圖

采用薄層層析法進(jìn)行展開(kāi)劑的多次嘗試后，確定最佳展開(kāi)劑為正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇=8∶1∶1。紫外光下觀察。在該展開(kāi)劑下，斑點(diǎn)分離清晰。

2.3 紅外光譜儀掃描結(jié)果

胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品紅外光譜掃描圖見(jiàn)圖3，胡桃醌樣品紅外光譜掃描圖見(jiàn)圖4。

圖3 胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品紅外光譜掃描圖

圖4 胡桃醌樣品紅外光譜掃描圖

比對(duì)紅外光譜圖，可知標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別在3 347，3 398出現(xiàn)第1個(gè)特征峰，在1 668，1 645出現(xiàn)第2個(gè)特征峰，在1 496，1 485出現(xiàn)第3個(gè)特征峰。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，在3 130~3 600 cm-1處的峰為羥基的伸縮振動(dòng)，在1 653~1 675 cm-1處的峰為羰基的伸縮振動(dòng)，在1 480~1 600 cm-1處的峰為苯環(huán)的骨架振動(dòng)。通過(guò)分析，胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的紅外圖譜特征吸收峰基本吻合，可進(jìn)一步推斷樣品中可能含有胡桃醌。

2.4 質(zhì)譜儀掃描結(jié)果

胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜掃描圖見(jiàn)圖5，胡桃醌樣品質(zhì)譜掃描圖見(jiàn)圖6。

圖5 胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜掃描圖

圖6 胡桃醌樣品質(zhì)譜掃描圖

胡桃醌屬于萘醌類化合物，通過(guò)查閱資料將范圍劃定到m/z為174左右。判定的標(biāo)準(zhǔn)為：①必須是該范圍譜圖內(nèi)的最大質(zhì)量的離子；②分子離子峰應(yīng)該滿足氮規(guī)則；③需要判斷與其相鄰的碎片離子之間的關(guān)系是否合理，其判斷標(biāo)準(zhǔn)是分子離子峰與較小的碎片離子峰相減能否產(chǎn)生合理的碎片丟失（△m）。

由圖5可知，將胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品的分子離子峰范圍劃定到質(zhì)荷比為176左右，并且滿足上圖該范圍之內(nèi)最大質(zhì)量；其次，萘醌類化合物中不包含氮原子，所以其分子離子峰質(zhì)量數(shù)為偶數(shù)，176為偶數(shù)；最后判斷△m=176.1-148.2=27.9≈28，△m=28表示化合物在電子的轟擊下打掉了一個(gè)CO，因此丟失合理。質(zhì)荷比為176.1的離子峰符合這些條件，可以假定該范圍為分子離子峰。

3 結(jié)論

甲醇-水（3∶1） 為提取劑，在超聲波恒定的條件下，超聲波微波萃取儀優(yōu)化方案為溫度40，45，50℃；微波頻率100，200，300 MHz；超聲波功率850，900，800 W；模式15∶10，電機(jī)轉(zhuǎn)速900 r/min。

在展開(kāi)劑為正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇=8∶1∶1下，供試樣液的斑點(diǎn)與胡桃醌對(duì)照品有大致相同的Rf值，薄層層析色譜分離技術(shù)在20℃的環(huán)境下展開(kāi)效果較好，分離效果更為清晰。

該單體含有苯環(huán)、羥基、羰基，與醌類化合物的官能團(tuán)一致，其相對(duì)分子質(zhì)量在碎片丟失范圍內(nèi)。該方法可行性高、簡(jiǎn)便可靠，適用于從核桃青皮中進(jìn)行物質(zhì)的制備分離。