高溫大曲中產(chǎn)香酵母的篩選及特征香氣分析

盧延想，梁慧珍，陳鵬，劉正，鐘成*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院，天津 300410）

酵母菌是白酒釀造過程中必不可少的一類微生物，其種類和數(shù)量直接影響白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。醬香型白酒采用高溫制曲工藝，大曲發(fā)酵階段最高溫度可達(dá)65℃。由于酵母菌普遍不耐高溫，主要在溫度較低的制曲前期大量繁殖，一般占總微生物數(shù)量的2%～5%，隨著曲塊發(fā)酵溫度升高酵母菌逐漸死亡，因此制曲后期很少檢出酵母菌[1]。大曲出倉后會經(jīng)過3個月～6個月的儲藏期，曲房長期處于通風(fēng)陰涼干燥狀態(tài)，環(huán)境中的酵母菌和大曲中存活或休眠的酵母菌在大曲上富集和二次生長，因此儲藏后的大曲中能夠檢測到少量酵母菌[2]。隨后，曲塊粉碎后通過撒曲進(jìn)入發(fā)酵制酒過程。

孔維兵等[3]從醬香大曲中分離到60株酵母，它們分屬7個不同的屬，分別為伊薩酵母屬（Issatchenkiasp.）、假絲酵母屬（Candida sp.）、絲孢酵母（Trichosporon sp.）、酵母屬（Saccharomyces sp.）、德巴利酵母屬（Debaryomyces sp.）、畢赤氏酵母屬（Pichia sp.）和復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis sp.）。 羅方雯等[4]運用高通量測序技術(shù)從茅臺鎮(zhèn)7個主釀酒區(qū)域的大曲中共檢出33個酵母屬，其中復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）是絕對優(yōu)勢酵母屬；韋元琪等[5]在高溫酒曲里篩得一株耐鹽且高產(chǎn)海藻糖的庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。蔡雪梅等[6]篩選到一株產(chǎn)香較好并在酒醅發(fā)酵過程中不影響其它風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）；羅小葉等[7]從高溫大曲中篩得一株產(chǎn)醇和產(chǎn)酯能力較強的扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）；劉茗銘[8]從大曲中篩得一株高產(chǎn)苯乙醇（113.63 μg/g）的扣囊復(fù)膜酵母；WU Q等[9]從酒醅中篩選出9種酵母，并且釀造環(huán)境的溫度和酸度會影響白酒風(fēng)味物質(zhì)的生成。產(chǎn)香酵母可以通過對酸和醇的酯化作用，生成使酒口感醇厚的酯類物質(zhì)[10]。本研究從高溫大曲中篩選產(chǎn)香酵母，解析其主要代謝產(chǎn)物，并模擬酒廠進(jìn)行發(fā)酵，探索產(chǎn)香酵母對白酒釀造的影響以及應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫大曲：取自貴州國臺酒廠；酵母蛋白胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基、YPD 瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁液體培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；糖化酶（15 000 U/g）：市售；真菌DNA提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[6]的方法制備。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基中加入葡萄糖10%、乙酸0.5%、乙醇2%。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S26型水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；BX53型電子顯微鏡：日本OLYMPUS公司；ZHWY-200D型搖床：上海智城分析儀器公司；SHP-250B型生化培養(yǎng)箱；天津天宇實驗儀器公司；64R型離心機：美國 Beckman Coulter公司；50/30μm DVB/CAR/PDMS Stableflex萃取頭：美國SUPELCO公司；Trace1310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Trace1310氣相色譜儀：美國Thermo Fisher公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌的分離純化

準(zhǔn)確稱取25 g醬香大曲置于225 mL生理鹽水（0.9% NaCl）中，150 r/min 搖床振蕩 30 min，充分混合后靜置，取100 μL上清液進(jìn)行平板涂布、平板劃線分離。

1.3.2 產(chǎn)香酵母的初篩

將分離純化后的菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)24h。以2%接種量接于100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)6 d。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液5 000 r/min離心15 min，過0.22 μm濾膜。參照GB/T 10345—2007《白酒分析方法》測定發(fā)酵液的總酯[11]，篩選產(chǎn)酯香較好的酵母菌做下一步復(fù)篩。

1.3.3 產(chǎn)香酵母的復(fù)篩

在黑暗中她頭暈得想要嘔吐，她先是扶住了欄桿，然后呻吟一樣喚了一聲汪小波。汪小波在暗中板過她的肩頭，她的淚適時地淌了出來。

將初篩酵母接種于30mL麥芽汁液體培養(yǎng)基，30℃、150 r/min培養(yǎng)36 h擴培至108cfu/mL，以5%接種量接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃恒溫發(fā)酵15 d。取2 g發(fā)酵產(chǎn)物于頂空瓶中，加入10 mL飽和氯化鈉溶液，再加入乙酸薄荷酯內(nèi)標(biāo)20 μL（100 mg/L）。60℃頂空瓶中預(yù)熱10 min后插入固相萃取頭吸附40 min，萃取結(jié)束后立即插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）進(jìn)樣口熱解吸 5 min。 色譜條件：HP-FFAP石英毛細(xì)管柱（50m×0.20mm×0.33μm）；升溫條件：柱溫箱溫度50℃保持3 min，以3℃/min升溫至170℃，再以6℃/min升溫至230℃保持5 min，總檢測時間50 min；載氣流速1.5 mL/min；分流比設(shè)為不分流；溶劑延遲4 min；質(zhì)量掃描范圍m/z 30 amu～550 amu，檢索NIST庫，選取匹配度大于800的物質(zhì)，采用內(nèi)標(biāo)法計算化合物的含量。

1.3.4 菌株鑒定

1.3.4.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察及生理生化試驗

菌落形態(tài)觀察：將菌株劃線轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)2 d，觀察并記錄菌落形狀、顏色、邊緣、光滑度、菌落硬度等菌落特征；細(xì)胞顯微鏡觀察：將酵母接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)24h，100倍油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征。

生理生化試驗：參照文獻(xiàn)[12-13]，進(jìn)行糖發(fā)酵試驗、碳源同化試驗、尿素水解試驗、產(chǎn)類淀粉試驗。

1.3.4.2 菌株分子鑒定

按照真菌DNA提取試劑盒說明書提取酵母DNA，采用真菌通用引物ITS1、ITS4擴增ITS區(qū)，將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物送至華大基因股份有限公司進(jìn)行18S rDNA序列測序。將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對，選取基因序列同源性較高的相關(guān)酵母菌株的18S rDNA區(qū)域序列作為參比對象，用MEGA7.0進(jìn)行相似性分析并用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 產(chǎn)香酵母的模擬生產(chǎn)發(fā)酵試驗

使用GC檢測蒸餾酒樣中的25種骨架成分[14]，用2-乙基丁酸、叔戊醇、乙酸正戊酯做內(nèi)標(biāo)。氣相色譜條件：檢測器為氫火焰離子化檢測器；載氣為氮氣；氫氣流速為35 mL/min，空氣流速為350 mL/min；進(jìn)樣口溫度200℃，檢測器溫度250℃；進(jìn)樣量1μL，分流比20∶1；采用 HP-FFAP（30 m×0.53 mm×1.00 μm）色譜柱；升溫條件：初始溫度37℃，保持7 min；5℃/min升至80℃；以10℃/min升至100℃，保持4 min；再以15℃/min升至200℃，保持7 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離純化

從高溫大曲中共分離純化出15株酵母菌，編號為Y1～Y15，菌落形態(tài)如表1所示。

表1 酵母菌落形態(tài)描述Table 1 Description of yeast colony morphology

2.2 產(chǎn)香酵母的初篩

酵母產(chǎn)酯能力是酵母產(chǎn)香的重要指標(biāo)，酵母發(fā)酵液總酯含量見圖1。

圖1 酵母發(fā)酵液總酯含量Fig.1 Total ester content in yeast fermentation broth

如圖1所示，通過測定酵母發(fā)酵液中的總酯含量，從中篩出7株產(chǎn)酯能力較強的酵母菌Y1、Y3、Y5、Y8、Y9、Y11、Y12 進(jìn)行下一步復(fù)篩。

2.3 產(chǎn)香酵母的復(fù)篩

將初篩得到的7株酵母菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，然后對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行感官評價和頂空固相微萃取及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（headspace solid-phase microextractiongas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GCMS）檢測，對檢出揮發(fā)性香氣化合物按照類別分為醇類、酯類、酸類、芳香類、酮類、醛類和其它化合物，結(jié)果如圖2和表2所示。

如圖2和表2所示，菌株Y3和Y5檢出的揮發(fā)性香氣化合物含量最高，并且其發(fā)酵產(chǎn)物都呈濃郁的果香味。

表2 菌株Y3和Y5揮發(fā)性香氣化合物含量及香氣描述Table 2 Strains Y3 and Y5 volatile aroma compound content and aroma description

續(xù)表2 菌株Y3和Y5揮發(fā)性香氣化合物含量及香氣描述Continue table 2 Strains Y3 and Y5 volatile aroma compound content and aroma description

菌株Y3和Y5發(fā)酵產(chǎn)物共檢出45種風(fēng)味物質(zhì)，總含量分別為 1 410.80 μg/g和 1 019.62 μg/g；從 Y3 中檢出43種發(fā)酵產(chǎn)物，醇類物質(zhì)含量較多的是異戊醇（255.98 μg/g）和 1-辛烯-3-醇，異戊醇口感微甜，適當(dāng)?shù)拇碱悓Π拙破鸬街阕饔肹15]；酯類物質(zhì)較多的是丁酸乙酯（46.97 μg/g）、乙酸異戊酯、己酸乙酯（31.39 μg/g）和γ-癸內(nèi)酯，丁酸乙酯和己酸乙酯屬于白酒四大酯，由于其香氣活性值較高，是構(gòu)成白酒獨特風(fēng)格的重要物質(zhì)[16]；γ-癸內(nèi)酯是較為關(guān)鍵的香氣物質(zhì)且主要是通過酵母菌代謝產(chǎn)生[17]。酸類物質(zhì)含量較多的有異戊酸（137.54 μg/g）和異丁酸；芳香類化合物β-苯乙醇含量高達(dá)651.32 μg/g，是白酒釀造過程中大曲、酒醅、白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)，賦予白酒玫瑰花香味[18-20]；Y5發(fā)酵產(chǎn)物檢出37種風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類物質(zhì)含量較少；酯類含量較多的有丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯；酸類物質(zhì)含量較多的是異戊酸（137.54 μg/g）；芳香類物質(zhì)最多，含量最高的是 β-苯乙醇（541.01 μg/g），其次為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，含量高達(dá)189.83 μg/g，它是醬香型白酒大曲中重要的呈香物質(zhì)之一[21-22]。

2.4 產(chǎn)香菌株的鑒定

2.4.1 菌株形態(tài)學(xué)以及生理生化試驗鑒定

菌株Y3和Y5菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖3。

對菌株Y3和Y5進(jìn)行顯微鏡檢，如圖3所示，Y3生殖方式為芽殖，有假菌絲；Y5生殖方式為芽殖，無假菌絲。菌株Y3和Y5的生理生化試驗結(jié)果見表3。

圖3 菌株Y3和Y5菌落及細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Colony and cell morphology of strains Y3 and Y5

由表3可知，菌株Y3能利用蔗糖、葡萄糖和麥芽糖，不能利用乳糖，不能利用硝酸鉀和分解尿素，不能產(chǎn)類淀粉；菌株Y5能利用蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、硝酸鉀和尿素，不能利用乳糖，不能產(chǎn)類淀粉。結(jié)合顯微鏡檢初步判斷Y3屬于復(fù)膜孢酵母屬，Y5屬于威克漢姆酵母屬。

表3 菌株Y3和Y5的生理生化試驗Table 3 Physiological and biochemical experiments of strains Y3 and Y5

2.4.2 菌株分子鑒定

將Y3和Y5菌株測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，選取同源性較高菌株的18S rDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4、圖5所示。

圖4 酵母菌Y3系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of yeast Y3

圖5 酵母菌Y5系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of yeast Y5

菌株Y3與扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera KF717373.1）同源性最高，相似度為100%，由此可以確定菌株Y3為扣囊復(fù)膜酵（Saccharomycopsis fibuligera）；菌株Y5與異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus MT940583.1）同源性最高，相似度為99%，故確定菌株Y5為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

2.5 產(chǎn)香酵母的模擬生產(chǎn)發(fā)酵試驗

發(fā)酵酒醅蒸餾酒樣化合物含量見表4。

表4 發(fā)酵酒醅蒸餾酒樣化合物含量Table 4 Contents of fermented mash distilled wine-like compounds

發(fā)酵酒醅蒸餾酒樣經(jīng)GC檢測，共測出12種骨架成分，添加酵母Y3的酒醅蒸餾酒樣乙酸乙酯和乳酸乙酯含量分別增加了54.17%和43.24%，乙酸含量降低了35.08%，其它物質(zhì)含量變化較小；添加酵母Y5的酒醅蒸餾酒樣苯乙醇含量提高了118.33%，異戊醇含量提高了22.67%，其它物質(zhì)含量變化較小，其它風(fēng)味物質(zhì)變化較小的原因可能是釀酒酵母對于產(chǎn)香酵母的生長有抑制作用[23-24]；等比例添加酵母Y3和Y5的酒醅蒸餾酒樣乙酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇的含量分別提高了41.66%、56.76%、92.37%，并且感官聞香上更加協(xié)調(diào)和豐富。因此，產(chǎn)香酵母Y3和Y5可以用于白酒的釀造中，提高酒體中的酯類物質(zhì)和芳香類物質(zhì)的含量，從而提升白酒品質(zhì)。

3 結(jié)論

從高溫大曲中經(jīng)過分離純化、液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)香初篩和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)香復(fù)篩，獲得兩株產(chǎn)香較好的酵母菌株Y3和Y5，菌株Y3、Y5固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)HS-SPMEGC-MS分別檢出43種和37種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，Y3固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物主要香氣物質(zhì)為β-苯乙醇（651.32μg/g）、異戊醇（255.98 μg/g）、異戊酸（137.54 μg/g）和丁酸乙酯；Y5固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物主要香氣物質(zhì)為β-苯乙醇（541.01 μg/g）、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（189.83 μg/g）和異戊酸。經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化試驗以及分子鑒定確定Y3為扣囊復(fù)膜酵母（Scchromycopsis fibuliger），Y5為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。將Y3、Y5以及Y3和Y5等比例混合的菌懸液加至酒醅中進(jìn)行模擬醬香型白酒生產(chǎn)發(fā)酵，使用GC測定蒸餾液中骨架成分。結(jié)果表明，Y3、Y5等比例混菌發(fā)酵使酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇的含量分別提升41.66%、56.76%、92.37%，使酒體更加協(xié)調(diào)。驗證了產(chǎn)香酵母對于提高白酒風(fēng)味物質(zhì)含量的重要作用[25]，進(jìn)一步展現(xiàn)了產(chǎn)香酵母在白酒釀造過程中的應(yīng)用前景。