microRNA-1290通過 NDRG1/NF-κB/IL-6信號通路促進結(jié)腸癌細胞遷移和侵襲

莫輝， 徐岷

(江蘇大學附屬醫(yī)院消化科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

結(jié)腸癌是全球最常見惡性消化道癌癥類型之一，我國每年有近19.1萬人死于結(jié)腸癌并呈逐年上升趨勢[1]。由于早期癥狀易被忽視，缺乏特異性診斷標志等因素，造成多數(shù)結(jié)腸癌患者在初次就診時即為中晚期，此時予綜合治療后預后普遍較差[2]。研究顯示，結(jié)腸癌細胞中持續(xù)活化的核因子κB蛋白(nuclear factor kappa-B kinase， NF-κB) 信號可通過產(chǎn)生大量IL-6促進其上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、浸潤、侵襲以及轉(zhuǎn)移發(fā)生[3]。目前調(diào)控結(jié)腸癌細胞中NF-κB/IL-6信號活化的分子機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，眾多微小RNA (microRNA，miRNA)參與結(jié)腸癌的惡性進展，其中miR-1290可能影響結(jié)腸癌不良預后[4]。然而，miR-1290是否參與結(jié)腸癌遷移和侵襲發(fā)生尚不清楚，因此本研究將圍繞miR-1290與IL-6在結(jié)腸癌細胞EMT、遷移及侵襲進程中相關(guān)作用，探討miR-1290調(diào)控NF-κB/IL-6信號通路活化的具體分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本、細胞株 選取2017年4月至2019年6月在江蘇大學附屬醫(yī)院胃腸外科住院的48例結(jié)腸癌患者(均經(jīng)江蘇大學附屬醫(yī)院病理科確診)，術(shù)前未經(jīng)任何治療并保留完整的臨床資料，于根治性切除手術(shù)中收集結(jié)腸癌瘤體及癌旁組織(距腫瘤瘤體邊緣1～2 cm)標本。患者臨床資料(病理類型、性別、年齡、分化程度、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等)從病歷記錄中獲取，均為腺癌；男24例，女24例；年齡48～85歲，中位年齡64歲，其中<64歲24例；低分化6例，中分化37例，高分化5例；Ⅰ期7例，Ⅱ期23例，Ⅲ期15例，Ⅳ期3例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例。以上研究均得到江蘇大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準并取得患者知情同意。

人結(jié)腸癌SW480，SW620和HT29細胞系購自上海吉凱基因技術(shù)公司；人正常結(jié)腸上皮HCoEpiC細胞購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.2 主要試劑 兔抗人NF-κB蛋白抗體、兔抗人磷酸化的NF-κB(p-NF-κB)抗體、兔抗人N-myc下游調(diào)節(jié)基因1(N-Myc downstream-regulated gene 1，NDRG1)抗體、兔抗人E-鈣黏素抗體、兔抗人波形蛋白抗體以及小鼠抗人β-肌動蛋白單克隆抗體均為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；兔抗人IL-6抗體及兔抗人同型對照IgG(美國Abcam公司)；Trizol及LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)； miR-1290類似物(上調(diào)miR-1290表達)，miR-1290抑制劑(抑制miR-1290表達)，相應陰性對照(不靶向任何已知的人、小鼠和大鼠基因)，IL-6小干擾RNA(siRNA-IL-6，si-IL-6)和siRNA陰性對照均購自上海吉瑪生物技術(shù)有限公司；HRP標記的山羊抗小鼠IgG、HRP標記的山羊抗兔IgG、DAB及牛血清白蛋白購自北京索萊寶科技有限公司；L-15、DMEM、EMEM和McCoy′s 5A培養(yǎng)基均為蘇州Thermo Fisher公司產(chǎn)品；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(包括miRNA一步法標準cDNA合成試劑盒)、熒光定量PCR試劑盒及BCA法蛋白質(zhì)定量試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染處理 SW480、SW620及HT-29細胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的L-15、DMEM和McCoy′s 5A培養(yǎng)基中；HCoEpiC細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的EMEM中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行傳代。將生長狀態(tài)良好的SW620、HT-29細胞常規(guī)消化，用無雙抗的完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整濃度至1×105/孔；分別接種于6孔板；次日達60%～70%融合度時進行轉(zhuǎn)染。

配制轉(zhuǎn)染試劑/轉(zhuǎn)染物混合物：分別取各組轉(zhuǎn)染物，miR-1290類似物，miRNA-1290抑制劑和陰性對照以及轉(zhuǎn)染試劑2 μL，稀釋于250 μL無血清培養(yǎng)基中，輕吹混勻、室溫孵育5 min；將上述轉(zhuǎn)染物與轉(zhuǎn)染試劑稀釋液混合，室溫孵育20 min；加入至已經(jīng)接種細胞的6孔板內(nèi)，補充每孔無血清培養(yǎng)基至2 mL，孵育6 h；棄轉(zhuǎn)染混合物，更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)或進行后續(xù)實驗。

1.2.2 免疫組織化學染色法檢測結(jié)腸癌組織中IL-6表達 48例結(jié)腸癌組織及癌旁組織樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋，連續(xù)切片，脫蠟處理，過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS浸洗3次，于0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液中95 ℃抗原修復15 min；加入兔抗人IL-6抗體(1 ∶400)于4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)，37 ℃孵育60 min；PBS清洗3次，DAB顯色并封片，顯微鏡下觀察。用PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性染色結(jié)腸癌切片做陽性對照。以200倍鏡下隨機選取5個視野(避開組織切片邊緣)進行評分。

IL-6表達評分標準參考文獻[5]：無著色記為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色計為3分；陽性表達區(qū)域評分：<25%為0分，25%≤1分<50%，50%≤2分<75%，≥75%為3分；將二者相乘取均分(總分≥5分為強陽性表達)。

1.2.3 qRT-PCR法檢測相關(guān)mRNA表達

1.2.3.1 癌組織中miR-1290、IL-6 mRNA檢測 從48例腫瘤組織中隨機選取20例，按Trizol說明書要求提取RNA。所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司設計并合成，具體序列如下，IL-6：上游5′-AGTCCTGATCCAGTTCCTGC-3′；下游5′-CTACATTTGCCGAAGAGCCC-3′；β-肌動蛋白：上游5′-GCTACGAGCTGCCTGACGG-3′；下游5′-TGTTGGCGTACAGGTCTTTGC-3′；miR-1290：5′-UGGAUU-UUUGGAUCAGGGA-3′；U6：5′-CTCGCTTCGGCAGC-ACA-3′。 qRT-PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火30 s，延伸，共40個循環(huán)。通過公式2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。實驗重復3次。

1.2.3.2 結(jié)腸癌細胞和HCoEpiC細胞中miR-1290及IL-6 mRNA、NDRG1 mRNA檢測 取對數(shù)生長期SW480、SW620、HT-29以及HCoEpiC細胞，分別接種于6孔板(1×105細胞/孔)，培養(yǎng)24 h；提取RNA，檢測miR-1290表達，方法同“1.2.3.1”。

將SW620細胞分為對照組(僅作換液處理)，陰性對照組(陰性對照RNA)，miR-1290類似物處理組(miR-1290類似物)；將HT-29細胞分為對照組，陰性對照組，miR-1290抑制劑組(miR-1290抑制劑)；相應轉(zhuǎn)染處理后按Trizol說明書要求提取RNA，進一步逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進行檢測。引物序列如下，NDRG1：上游5′-TGGACCCAACAAAGACCACT-3′；下游 5′-CCATCCAGAGAAGTGACGCT-3′；以β-肌動蛋白為內(nèi)參計算NDRG1、IL-6 mRNA相對表達量。IL-6、β-肌動蛋白引物序列及檢測方法同“1.2.3.1”。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)腸癌細胞中NDRG1、EMT及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白 取對數(shù)生長期SW620及HT-29細胞，同“1.2.3.2”分組處理，轉(zhuǎn)染處理72 h；PBS洗3次，于冰上加入100 μL RIPA裂解液刮拭；收集細胞裂解液，4 ℃，12 000×g離心10 min；取上清液；BCA法測定蛋白含量；根據(jù)濃度加入不等上樣緩沖液，100 ℃熱變性10 min，于-80 ℃保存。取50 μg蛋白上樣，先60 V將蛋白壓至積層膠，再調(diào)100 V待蛋白跑至膠底部；300 mA 恒流轉(zhuǎn)PVDF膜60～120 min；用含5%牛血清白蛋白的 TBST室溫孵育60 min；加入1 ∶1 000稀釋的兔抗NDRG1抗體、兔抗NF-κB抗體、兔抗p-NF-κB抗體、小鼠抗β-肌動蛋白單克隆抗體、兔抗E-鈣黏素抗體、兔抗波形蛋白抗體，4 ℃孵育過夜；次日用TBST 洗3次，每次10 min；置于HRP標記的山羊抗小鼠IgG或抗兔IgG(1 ∶5 000)二抗室溫繼續(xù)孵育60 min；TBST洗膜3次，每次10 min；加入曝光液顯影、拍攝并計算光密度值。

1.2.5 ELISA試驗檢測IL-6外泌表達量 SW620及HT-29細胞轉(zhuǎn)染分組同“1.2.3.2”，處理48 h(統(tǒng)一細胞量待檢測時為1×106/孔)；收集細胞上清液，300×g離心10 min；收集上清液于-80 ℃保存，待ELISA檢測前1 h取樣品于4 ℃解凍。將所有ELISA試劑放于室溫下平衡，按照試劑盒說明書說明，稀釋標準品以及對待檢測的上清樣品進行預處理；計算總樣本數(shù)(包括標準品孔，空白孔，樣品孔并設復孔)，浸泡包被96孔板，加入各樣本后再加入稀釋好的一抗，室溫振蕩孵育1.5 h；清洗3次；每孔分別加入稀釋的HRP標記的鏈霉親和素，室溫孵育30 min；洗滌3次；加入底物TMB顯色20 min；每孔加入終止液，用酶標儀檢測450 nm處光密度。

1.2.6 劃痕實驗檢測結(jié)腸癌細胞遷移能力 取對數(shù)生長期SW620細胞(1×105細胞/孔)，接種于6孔板，分為對照組、陰性對照組、miR-1290類似物處理組、siRNA陰性對照組和siRNA-IL-6組；其中，選取轉(zhuǎn)染miR-1290 類似物SW620細胞，繼續(xù)用siRNA-IL-6轉(zhuǎn)染后換液培養(yǎng)24 h作為miR-1290 類似物+siRNA-IL-6處理組；待細胞融合達95%左右時，用200 μL槍頭按直線進行縱向劃痕；PBS清洗，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；隨機選擇5個視野分別于0 h和24 h測量細胞愈合率，細胞愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復3次，每次設3個平行復孔。

1.2.7 Matrigel侵襲小室實驗檢測結(jié)腸癌細胞侵襲能力 將SW620細胞培養(yǎng)處理24 h；消化，將5×104個細胞重懸于200 μL無血清培養(yǎng)基中種于上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基；隨機選取小室分為對照組、陰性對照組、miR-1290類似物組、同型對照抗體組(抗體稀釋比為1 ∶400)、特異性抗體中和外泌IL-6(抗IL-6)組以及miR-1290類似物+抗IL-6組；繼續(xù)培養(yǎng)48 h；用棉簽去除未侵襲細胞；100%甲醇固定15 min；0.1% 結(jié)晶紫溶液室溫染色5 min，于顯微鏡下200倍觀察，每組計數(shù)5個視野；實驗重復3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 IL-6、miR-1290在結(jié)腸癌組織及細胞中均呈高表達

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中伴隨著腫瘤細胞分布可見大量的IL-6陽性、強陽性的表達區(qū)域，而癌旁組織中有零星IL-6弱陽性區(qū)域，呈現(xiàn)無規(guī)律散布，整體表達強度偏低。免疫組化評分結(jié)果顯示IL-6在結(jié)腸癌中評分明顯高于對應的癌旁組織(Z=7.713，P<0.01)。見圖1。qRT-PCR結(jié)果證實，結(jié)腸癌瘤體內(nèi)miR-1290與IL-6 mRNA表達呈明顯正相關(guān)(r=0.845 4，P<0.01，圖2)。細胞實驗結(jié)果表明，結(jié)腸癌SW480、SW620及HT-29細胞中miR-1290表達明顯高于HCoEpiC結(jié)腸上皮細胞(P均<0.01)。見圖3。

圖1 結(jié)腸癌組織和癌旁組織中IL-6表達(×100)

圖2 qRT-PCR檢測結(jié)腸癌組織中miR-1290與IL-6 mRNA表達及二者之間相關(guān)性

圖3 結(jié)腸癌SW480、SW620、HT-29細胞及正常結(jié)腸上皮HCoEpiC細胞中miR-1290表達

2.2 miR-1290促進NF-κB信號通路活化及EMT發(fā)生

miR-1290類似物和抑制劑可以有效促進miR-1290顯著上調(diào)(t=24.33，P<0.01)或抑制其表達(t=87.88，P<0.01)。見圖4。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與對照組及陰性對照組相比， miR-1290類似物組NDRG1、E-鈣黏素表達顯著抑制，而p-NF-κB和波形蛋白表達增強；與對照組及陰性對照組相比，miR-1290抑制劑組中NDRG1和E-鈣黏素表達升高，p-NF-κB、波形蛋白表達降低(P均<0.01)；miR-1290 類似物組(t=0.38，P=0.71)、miR-1290抑制劑組(t=0.14，P=0.90)與各自對照組細胞相比，NF-κB表達量均無顯著改變。見圖5。

a：P<0.01,與對照組比較；b：P<0.01,與陰性對照組比較

2.3 miR-1290調(diào)控NDRG1表達及IL-6表達、分泌

qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組及陰性對照組比較， miR-1290類似物組NDRG1 mRNA表達顯著降低(t=18.48，P<0.01)，IL-6 mRNA表達明顯增加(t=37.71，P<0.01)；與對照組及陰性對照組相比，miR-1290抑制劑組NDRG1 mRNA表達明顯增加(t=56.92，P<0.01)，IL-6 mRNA表達顯著降低(t=62.81，P<0.01)。見圖6。

a：P<0.01,與對照組比較；b：P<0.01,與陰性對照組比較

ELISA結(jié)果顯示，與各自對照組相比，miR-1290 類似物組IL-6外泌量明顯增加(t=28.36，P<0.01)，miR-1290抑制劑組IL-6外泌量明顯降低(t=32.32，P<0.01)。見圖7。

a：P<0.01,與對照組比較；b：P<0.01,與陰性對照組比較

2.4 miR-1290通過IL-6參與結(jié)腸癌細胞遷移及侵襲進程

劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，si-IL-6組細胞愈合率明顯降低(t=21.51，P<0.01)；而miR-1290類似物組愈合率明顯上調(diào)(t=17.10，P<0.01)；miR-1290類似物+si-IL-6組愈合率較miR-1290類似物組顯著降低(t=36.16，P<0.01)。見圖8。侵襲小室實驗進一步證實，抗IL-6組結(jié)腸癌細胞侵襲數(shù)顯著下降(t=45.52，P<0.01)；miR-1290類似物組細胞侵襲數(shù)較對照組顯著增加(t=20.01，P<0.01)；miR-1290類似物+抗IL-6組細胞侵襲數(shù)較miR-1290類似物組明顯降低(t=22.64，P<0.01)。見圖9。

a：P<0.01,與對照組比較；b：P<0.01,與miR-1290類似物組比較

a：P<0.01,與對照組比較；b：P<0.01,與miR-1290類似物組比較

3 討論

近年來大量研究顯示，廣泛分布在細胞內(nèi)、血液以及分泌物中的miRNA因其莖環(huán)結(jié)構(gòu)和較小體積不易被RNA酶降解等特點，可作為臨床檢測指標[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1290表達上調(diào)往往預示著卵巢癌[7]、胰腺癌[8]、食管鱗癌[9]等惡性腫瘤患者的不良預后；胃癌細胞來源中miR-1290可促進腫瘤惡性增殖和侵襲發(fā)生[10]。本研究證實，相較于癌旁組織，結(jié)腸癌組織中miR-1290表達明顯增高；與之相一致的是，不同結(jié)腸癌細胞株中miR-1290表達量也均明顯高于正常結(jié)腸上皮細胞，提示miR-1290異常高表達可能與結(jié)腸癌惡性生物學行為有關(guān)。目前普遍認為，IL-6參與包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤EMT發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等進程[3]。本研究免疫組化結(jié)果顯示，結(jié)腸癌中IL-6表達強度明顯高于癌旁組織；同時，IL-6 mRNA與miR-1290表達量呈正相關(guān)，表明結(jié)腸癌中miR-1290可能與IL-6表達存在密切聯(lián)系。后續(xù)結(jié)合miR-1290類似物、抑制劑后發(fā)現(xiàn)，上調(diào)或抑制miR-1290可以顯著增強或降低IL-6的轉(zhuǎn)錄和外泌水平，但是miR-1290調(diào)控IL-6表達的相關(guān)機制以及是否參與結(jié)腸癌EMT發(fā)生、遷移、侵襲等還需進一步研究。

異常表達的miRNA可通過調(diào)節(jié)多種關(guān)鍵信號通路活化，各種抑癌或者癌基因表達等作用于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]。研究表明，過度激活或者受控的NF-κB信號可通過磷酸化IκB并使其泛素化降解，進而促其下游靶基因IL-6表達并參與結(jié)腸癌細胞EMT、侵襲、轉(zhuǎn)移等發(fā)生[4]。本研究蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，靶向上調(diào)或下調(diào)miR-1290會引起NF-κB信號通路的持續(xù)激活或者明顯抑制。有結(jié)腸癌相關(guān)研究表明，作為NF-κB信號通路活化的負性調(diào)控蛋白，NDRG1可以阻斷IκBα磷酸化以及介導NF-κB抑制物激酶α/β的降解抑制EMT發(fā)生[11]。本研究證實，結(jié)腸癌細胞中miR-1290表達上調(diào)可有效抑制NDRG1表達并促進EMT發(fā)生，而下調(diào)miR-1290可以迅速恢復NDRG1、E-鈣黏素表達以及抑制波形蛋白形成，上述結(jié)果與已有非小細胞肺癌的研究相同[12]，即miR-1290可能通過抑制NDRG1表達來維持腫瘤細胞中NF-κB信號通路的持續(xù)活化。為進一步驗證miR-1290/NDRG1/NF-κB信號調(diào)控是通過IL-6參與結(jié)腸癌遷移、侵襲進程，結(jié)合siRNA靶向抑制或者抗體中和通過劃痕實驗和Matrigel侵襲小室實驗證實，miR-1290促進結(jié)腸癌細胞遷移、侵襲形成，該進程依賴于IL-6的表達和分泌。然而，基于組織樣本特別是血液標本探究miR-1290是否伴隨結(jié)腸癌發(fā)展出現(xiàn)相應改變，以及動物模型的建立等還有待進一步驗證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-1290通過抑制NDRG1蛋白來促進結(jié)腸癌細胞中NF-κB信號通路活化，并通過其下游靶蛋白IL-6參與結(jié)腸癌細胞EMT發(fā)生、遷移以及侵襲能力增強，提示miR-1290可能作為一種促癌因子參與結(jié)腸癌不良預后的形成，因而檢測miR-1290有助于評估結(jié)腸癌患者預后，在動態(tài)監(jiān)控病情發(fā)展中也具有一定臨床價值。