IL-15、IL-18、IL-21和NK細胞在梅毒血清固定患者外周血中的含量及臨床意義

程文豪， 盧雨沫， 胡文龍， 劉忠倫， 任虹

(徐州醫科大學附屬連云港醫院皮膚性病科，江蘇 連云港 222000)

梅毒是由蒼白密螺旋體引起的慢性傳染性疾病，主要通過性接觸傳播。梅毒臨床表現多樣，且在全世界范圍內廣泛傳播[1]。梅毒目前主要依靠血清學檢查來診斷和評估治療效果[2]，大部分梅毒患者在正規治療后能達到臨床治愈和血清治愈(非梅毒螺旋體抗原實驗轉為陰性)，但有些患者可表現為長時間梅毒血清學陽性，這種情況稱為梅毒血清固定或血清抵抗[3-4]。近年來隨著梅毒發病率的顯著升高，血清固定的發生率也明顯有隨之升高趨勢[5]。梅毒患者出現血清固定的機制尚不明確，近來研究發現，梅毒血清固定患者的免疫功能發生了轉變[6]。

NK細胞是機體重要的免疫細胞，可以通過細胞毒機制直接殺傷病原體。NK細胞作為天然免疫系統的核心成員，在血清固定形成中發揮重要作用[7]。在免疫應答中，NK細胞增殖、分化、遷移等生物學效應受多種細胞因子的調節，其中IL-21[8-10]、IL-18[11-12]和IL-15[13-14]等細胞因子對NK細胞的調控作用尤為明顯。本研究從細胞免疫方面入手，比較梅毒血清固定患者與健康者外周血IL-15、IL-18、IL-21和NK細胞變化水平，并分析其臨床意義。

1 對象和方法

1.1 一般資料

選取2018年10月至2020年9月于徐州醫科大學附屬連云港醫院皮膚性病科收治的24例梅毒血清固定患者為血清固定組，其中男10例，女14例，平均年齡(34.79±12.61)歲(17～58歲)。血清固定平均時間(5.88±6.52)年(1～31年)，快速血漿反應素試驗(RPR)檢測滴度1 ∶1者6例，1 ∶2者5例，1 ∶4者8例，1 ∶8者5例。一期梅毒產生血清固定4例，二期梅毒5例，潛伏梅毒15例(表1)。TRUST試驗初始滴度為1 ∶2～1 ∶128。梅毒患者均經過規范的驅梅治療和充分隨訪(一期梅毒、二期梅毒和晚期梅毒隨訪時間分別為1年、2年和3年)，RPR滴度維持在1 ∶1～1 ∶8之間超過3個月，排除生物學假陽性、再感染、神經梅毒、心血管梅毒等。選取性別與年齡相匹配的24例梅毒螺旋體顆粒凝集試驗、RPR均陰性的健康體檢者作為健康對照組，其中男、女各12例，平均年齡(34.75±11.81)歲(19～57歲)。受試者納入標準：無嚴重感染性疾病、惡性腫瘤及免疫系統疾病，HIV抗體陰性，半年內未使用過免疫調節藥物，排除妊娠期女性。本研究通過徐州醫科大學附屬連云港醫院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

表1 24例梅毒患者血清固定形成時間和滴度

1.2 主要試劑和儀器

CD3 FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC四色試劑，血細胞分析用溶血劑均為美國Agilen公司產品；人IL-15、IL-18、IL-21定量 ELISA 試劑盒(南京福麥斯生物技術有限公司)；Multiskan MK3型酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；EDTA-K2抗凝劑的真空采血管、BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀均為美國BD公司產品。

1.3 血樣采集及處理

用含EDTA-K2抗凝劑的真空采血管，清晨采集受試者空腹肘靜脈血5 mL。取1 mL靜脈血至干燥潔凈的EP管內，做好標記(姓名、性別、年齡、采集時間)，室溫放置保存，24 h內檢測NK細胞水平。余4 mL靜脈血，于30 min內，室溫1 000×g離心15 min，取上層血漿，做好標記，于-80 ℃冰箱中保存，用于細胞因子IL-15、IL-18和IL-21水平檢測。

1.4 ELISA法檢測IL-15、IL-18和IL-21水平

將成倍稀釋的不同濃度標準品和待測血漿分別置于相應微孔，每孔100 μL，并增加1孔作為空白對照孔，每組設2個復孔，37 ℃孵育90 min；洗板4次，每孔加入生物素化抗體工作液100 μL，37 ℃孵育60 min；洗板4次，每孔加入酶結合物工作液50 μL，37 ℃孵育30 min；洗板4次，每孔加入顯色劑100 μL，37 ℃避光孵育10 min；每孔加入終止液100 μL，立刻用酶標儀在450 nm波長處測定各孔光密度值(D值)。以標準品D值和濃度繪制標準曲線(IL-15、IL-18和IL-21標準曲線R2分別為0.997 2、0.995 6、0.998 3)，計算樣本濃度。實驗步驟和方法均按照說明書嚴格執行。

1.5 流式細胞儀雙標法檢測外周血NK細胞水平

用反向加樣法取50 μL靜脈血加入流式管，再加入20 μL四色抗體試劑，輕輕充分混勻后，室溫靜置避光孵育15 min；然后加入450 μL紅細胞溶解劑，混勻，室溫靜置避光孵育15 min，流式細胞儀檢測。所有實驗方法的操作規程參照試劑及儀器的說明書嚴格進行。

1.6 血清固定組和健康對照組患者外周血中NK細胞水平Meta分析

中文檢索詞以“血清固定或血清抵抗”和“自然殺傷細胞或NK細胞”為并列檢索詞，英文檢索詞為“serofast or seroresistance” and “natural killer cells or NK cells”。計算機檢索中國知網、萬方、維普、PubMed、EmBase、Cochrane Library等數據庫，查找自建庫至2020年10月關于NK細胞和梅毒血清固定的文獻，檢索語言不限。排除標準：不滿足上述納入標準的研究；納入兒童、孕婦的研究；綜述性文獻；重復發表的文獻；資料不完整的研究。提取的數據包括文章作者、發表年份、樣本量和NK細胞比例(均數±標準差)。

1.7 統計學處理

采用Stata 15.0軟件進行Meta分析，計算95%CI和標準化平均差(standardised mean difference，SMD)， 進行統計學異質性檢驗，若P>0.1、I2≤50%，表示各研究之間不存在異質性，采用固定效應模型進行分析；若P<0.1、I2>50%，表示存在異質性，采用隨機效應模型進行分析。Egger′s檢驗評估發表偏倚。

2 結果

2.1 血清固定組與對照組外周血IL-15、IL-18和IL-21水平比較

由表2可見，血清固定組外周血IL-18和IL-21水平顯著低于健康對照組(U=6.402，t=5.939，P均<0.001)。與健康對照組相比，血清固定組外周血IL-15水平稍低，差異無統計學意義(t=1.385，P=0.173)。

表2 兩組外周血IL-15、IL-18、IL-21水平比較

2.2 血清固定組與對照組外周血NK細胞比例比較

流式細胞術檢測結果顯示，固定組外周血NK細胞比例[(17.57±5.23)%]明顯低于對照組[(23.46±7.66)%，t=3.105，P=0.003]。見圖1。

圖1 流式細胞術檢測血清固定患者與健康對照者外周血NK細胞表達水平

2.3 外周血中NK細胞水平Meta分析

鑒于本研究的樣本量較小，通過檢索策略檢索到文獻共267篇，按照文獻的納入和排除標準最終納入16篇文獻[15-30]進行Meta分析，納入研究的基本特征見表3，加上本次實驗數據，得到血清固定組655例，健康對照組586例。經同質性檢驗，各研究之間存在異質性(I2=92.20%，P<0.001)，故采用隨機效應模型進行分析，結果顯示與健康對照組相比，血清固定患者外周血NK細胞百分比明顯減低[SMD=-0.64，95%CI(-1.08，-0.21)，P<0.001]。見圖2。Egger′s 檢驗發現存在發表偏倚(P=0.296)。

表3 納入Meta分析研究的基本特征

圖2 血清固定組與對照組外周血NK細胞百分比Meta分析森林圖

3 討論

NK細胞在激活后迅速分泌大量細胞因子控制病原體的增殖，而且激活的速度和強度高于T細胞[31-33]。NK細胞在感染后可以迅速地被檢測到，是評估機體細胞免疫功能的常用指標。近年來，國內外越來越多學者研究證實梅毒血清固定的發生與機體免疫受到抑制有關[34-35]。本實驗結果顯示，血清固定患者外周血中NK細胞比例明顯低于健康對照組，提示血清固定患者免疫功能受到抑制，機體對梅毒螺旋體的免疫清除能力降低，可能引起血清固定。

既往有研究發現，與健康對照組相比，血清固定患者外周血中NK細胞水平明顯降低[15，21]。然而，也有學者指出血清固定患者外周血NK細胞水平與健康對照組相比未見降低[17]。這些結果研究樣本量均較小且結果并不一致，通過納入16篇文獻，加上本次實驗結果，共對655例血清固定患者和586例健康對照者進行Meta分析。結果顯示，血清固定組外周血NK細胞水平顯著低于健康對照組。本Meta分析檢索了國內外權威的中英文數據庫，納入所有關于NK細胞與梅毒血清固定，且符合標準的病例對照研究，但沒有檢索到國外的相關研究，僅展現國內地區NK細胞與梅毒血清固定相關性的研究情況。雖然結果也存在一定的異質性和發表偏倚，但是是對多個獨立臨床病例對照研究的薈萃分析，相較于單一臨床病例對照研究，受試者更多，覆蓋面更廣，結果可信度更高。

既往關于血清固定與NK細胞的研究主要集中于外周血中NK細胞自身水平的變化[16，19]，本研究在檢測NK細胞的同時，還探究了NK細胞上游細胞因子IL-21、IL-18和IL-15的水平；這些細胞因子可以獨立或協同正向調節NK細胞的數量和功能[33]。結果顯示，血清固定患者外周血中IL-21和IL-18水平明顯低于健康對照組，這也在一定程度上支持了前文得出的血清固定患者外周血中NK細胞水平降低的結論；但IL-15水平差異無統計學意義，可能與樣本量較小有關。

綜上所述，本研究發現梅毒血清固定患者外周血中NK細胞及其上游細胞因子IL-18、IL-21含量降低，提示梅毒血清固定患者免疫功能受抑制，對梅毒螺旋體的免疫清除能力減弱，梅毒螺旋體殘存于體內時間增長，可能是梅毒血清固定形成的原因之一。同時，外周血中NK細胞及其上游細胞因子IL-18、IL-21的含量或有望成為血清固定診斷的輔助指標。但目前研究的樣本量較小，還需高質量、多中心、大樣本進一步臨床驗證。