C14ORF169在結直腸癌中的表達及對化療和預后的影響

羅婷怡， 孫偉， 楊庭松， 王士林， 霍鈺虎， 韋海鴻， 徐彬

(同濟大學附屬上海市第十人民醫院普外科，上海 200072)

結直腸癌是全球高發惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率在所有癌癥中分別位居第三位和第二位[1-2]。我國結直腸癌發病率和死亡率呈逐年上升趨勢[3]。手術治療早期結直腸癌效果較好[4]，而中晚期患者預后較差，5年生存率不足15%[5]，化療耐藥是其預后不良的主要原因之一[6]。C14ORF169是定位于人體14號染色體上的基因，其表達C14ORF169蛋白，又名NO66，是含十字形結構域蛋白(Jumonji domain-containing, Jmjd)去甲基化酶家族中的一員[7]，在組蛋白編碼[8]和癌癥的發生進展中起重要作用[9-11]。研究顯示，C14ORF169在多種腫瘤中表達上調，包括肺癌[12]、腎癌[13]、前列腺癌[14]和神經膠質瘤[15]等，其高表達可促進腫瘤生長。Nishizawa等[16]發現，C14ORF169可能是結直腸癌新的預后標志物和潛在治療靶點。然而，C14ORF169通過何種機制影響結直腸癌發生發展，以及其對結直腸癌患者預后的影響尚不清楚。因此，本研究利用Oncomine數據庫，結合腫瘤相關的基因表達匯編(gene expression omnibus，GEO)數據，分析C14ORF169對結直腸癌患者預后的影響及其與臨床病理參數的相關性，同時通過細胞實驗探討C14ORF169表達對結直腸癌患者化療的影響。

1 材料與方法

1.1 數據篩選

1.1.1 數據收集與分析 利用基因表達譜在線分析平臺GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)分析C14ORF169在人31種腫瘤組織樣本及其相應正常組織中的差異表達。利用Oncomine數據庫(https://www.oncomine.org)篩選出C14ORF169在結直腸腺瘤、結直腸癌組織及相應正常組織中的表達數據，數據篩選條件：“Gene: C14ORF169”；“Analysis Type: Cancer vs. Normal Analysis”；“Cancer Type： Colorectal cancer”；“Data Type: mRNA”。

1.1.2 從GEO數據庫選擇數據 從美國國家生物技術信息中心(NCBI)的GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下載基因表達譜結直腸癌樣本數據集GSE12945和GSE17536。收集GEO數據集中具有完整臨床病理學參數和生存資料的病例。采用X-Tile軟件[17]確定C14ORF169 mRNA表達量的最佳截斷值，據此將數據進行二分類，低于該值為低表達組，高于則為高表達組。

1.2 細胞株、質粒載體及主要試劑

結腸癌RKO和HCT116細胞株、Lenti-CAS9-puro質粒、人腎上皮293T細胞、慢病毒表達載體GV371、GV513(BamHⅠ/NheⅠ酶切)、慢病毒包裝輔助質粒、慢病毒包裝試劑盒、大腸埃希菌、TOP 10感受態均購自上海吉凱基因化學技術有限公司。T7 DNA 連接酶、BbsⅠ、瓊脂糖凝膠購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、無內毒素小提中量試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；兔抗C14ORF169抗體(美國Abcam公司)；小鼠抗人GAPDH抗體(美國Santa Cruz公司)；引物由上海吉凱基因化學技術有限公司合成。

1.3 慢病毒構建與包裝

針對目的基因C14ORF169序列，設計小向導RNA(small guide RNA，sgRNA)引物序列：GCCAGGACCGACCCGCTGTG，插入慢病毒質粒載體Lenti-sgRNA-EGFP，獲得敲除質粒Lenti-C14ORF169-sgRNA-EGFP。從GV513載體獲得C14ORF169表達片段并插入慢病毒載體，獲得過表達質粒Lenti-C14ORF169-gcGFP。用空載對照質粒Lentil-CON-244-EGFP、敲除質粒Lenti-C14ORF169-sgRNA-EGFP、空載對照質粒Lentil-CON-335-gcGFP、過表達質粒Lenti-C14ORF169-gcGFP分別轉染293T細胞，按慢病毒包裝試劑盒說明書進行病毒包裝，48 h后收集上清液過濾，熒光法測定病毒滴度后-80 ℃保存。

1.4 慢病毒感染RKO、HCT116細胞及穩定敲除株與過表達株的篩選

將RKO細胞株、HCT116細胞株于5% CO2、37 ℃培養，取對數生長期細胞，以5 × 104個/孔接種于6孔板。加入Lenti-CAS9-puro慢病毒，感染72 h；加入嘌呤霉素篩選3 d至細胞狀態穩定。然后以同樣的方法在RKO細胞中感染Lenti-C14ORF169-sgRNA-EGFP慢病毒作為RKO-KO組(敲減C14ORF169)，感染對照質粒Lentil-CON-244-EGFP作為RKO-NC組；在HCT116細胞中感染Lenti-C14ORF169-gcGFP慢病毒作為HCT116-OE組(C14ORF169過表達組)，感染對照質粒Lentil-CON-335-gcGFP作為HCT116-NC組。收集細胞進行后續實驗。

1.5 免疫印跡法檢測細胞中C14ORF169蛋白表達

取“1.4”中HCT116-OE、HCT116-NC、RKO-KO、RKO-NC細胞樣品，PBS洗滌2次；加入預冷RIPA裂解液冰上裂解15 min；4 ℃ 12 000×g離心15 min；取上清液，BCA法測定蛋白濃度。在蛋白樣品中加入6×上樣緩沖液混勻，100 ℃水浴10 min；取40 μg總蛋白行10%SDS-PAGE分離；4 ℃ 300 mA恒流電轉150 min，將蛋白轉移到PVDF膜；用含5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉1 h；分別加入抗C14ORF169抗體與抗GAPDH抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜4次，每次8 min；二抗室溫孵育1.5 h(1 ∶7 500)；TBST洗膜4次，每次8 min；采用ECL增強化學發光法結合顯色儀進行蛋白檢測及發光，將曝光得到的目的條帶用Image J軟件進行灰度分析，得到的數值用GraphPad Prism 9作圖。

1.6 CCK-8法檢測細胞藥物敏感性

將篩選后的穩定株HCT116-OE、HCT116-NC、RKO-KO、RKO-NC分別接種于96孔板中(5 000細胞/孔)，分別給予不同濃度梯度(0，2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0，160.0 μg/mL)的5-氟尿嘧啶(5-FU)，于5% CO2、37 ℃分別孵育48、72 h；加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育4 h；用酶標儀于490 nm處測其光密度(D)值。根據不同濃度梯度下各組細胞的活性用GraphPad Prism 9繪制擬合曲線，計算5-FU半抑制濃度(IC50)。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 C14ORF169 mRNA在多種人體腫瘤組織及對應正常組織中的表達

基于GEPIA平臺分析TCGA數據庫中有關C14ORF169mRNA在人31種腫瘤組織樣本及其相應正常組織中的差異表達，結果顯示，C14ORF169mRNA在結直腸腺癌(Colon Adenocarcinoma, COAD/Rectum Adenocarcinoma, READ)、皮膚黑色素瘤(SKCM)、乳腺癌(BRCA)等大部分癌癥組織中呈高表達(圖1)。

ACC: 腎上腺皮質癌；BLCA：膀胱上皮癌；BRCA:乳腺癌；CESC：宮頸鱗狀細胞癌；CHOL：膽管癌；COAD：結腸腺癌；DLBC：彌漫大B細胞淋巴瘤；ESCA: 食管癌；GBM: 多形性膠質母細胞瘤；HNSC:頭頸鱗狀細胞癌；KICH：腎嫌色細胞癌；KIRC：腎透明細胞癌；KIRP: 腎乳頭狀細胞癌；LAML: 急性髓系白血病；LGG:腦低級別神經膠質瘤；LIHC：肝細胞癌；LUAD：肺腺癌；LUSC：肺鱗狀細胞癌；OV：卵巢漿液性囊腺癌；PAAD：胰腺癌；PCPG：嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤；PRAD：前列腺癌；READ: 直腸腺癌；SARC: 肉瘤；SKCM：皮膚黑色素瘤；STAD: 胃腺癌；TGCT：睪丸生殖細胞瘤；THCA：甲狀腺癌；THYM：胸腺瘤；UCEC：子宮內膜癌；UCS：子宮癌肉瘤

2.2 C14ORF169 mRNA在不同結直腸癌基因芯片中的表達

Oncomine數據庫分析結果顯示，C14ORF169mRNA在結直腸腺瘤和結直腸癌組織中的表達水平均高于正常組織。4項有關C14ORF169mRNA在結直腸腺瘤組織與正常組織中的表達差異分析顯示[18-19]，C14ORF169mRNA在結直腸腺瘤組織表達高于正常組織(P<0.001，圖2A)。將5項關于C14ORF169mRNA在結直腸癌組織與正常組織中表達差異的分析進行Meta分析，結果亦顯示，C14ORF169mRNA在結直腸癌組織中的表達顯著高于正常組織(P=0.001，圖2B)。

圖2 不同結直腸腫瘤芯片C14ORF169 mRNA研究的Meta分析

2.3 C14ORF169 mRNA表達水平與結直腸癌患者預后的相關性

在GSE12945數據集中，C14ORF169mRNA表達的最佳截斷值為10.75。將GSE12945數據集中62例結直腸癌患者按C14ORF169mRNA表達的最佳截斷值分為高表達組和低表達組。其中，高表達組10例，低表達組52例。采用log-rank法進行生存分析結果顯示，C14ORF169mRNA高表達患者總體生存時間和無病生存時間明顯短于低表達患者(P<0.05)。見圖3。在GSE17536數據集中，C14ORF169mRNA表達的最佳截斷值為9.44。177例結直腸癌患者按最佳截斷值分為高表達組和低表達組。其中，高表達組54例，低表達組123例。生存分析結果亦顯示，C14ORF169mRNA高表達組總體生存時間和疾病特異性生存時間明顯短于低表達組(P<0.05)。見圖4。

圖3 C14ORF169 mRNA表達與結直腸癌患者預后的關系(GSE12945數據集)

圖4 C14ORF169 mRNA表達與結直腸癌患者預后的關系(GSE17536數據集)

2.4 C14ORF169 mRNA表達水平與臨床病理參數的相關性

由表1可見，C14ORF169mRNA表達與結直腸癌AJCC分期密切相關，腫瘤組織C14ORF169mRNA表達越高，AJCC分期越晚(P<0.05)。而C14ORF169mRNA表達與年齡、性別、病理分級無明顯相關性(P>0.05)。由此提示，C14ORF169mRNA高表達可能促進結直腸癌轉移從而導致預后不良。

表1 C14ORF169 mRNA表達與臨床病理因素的關系 例

2.5 C14ORF169蛋白在結腸癌細胞中的表達

由圖5可見，與對照組RKO-NC細胞相比，RKO-KO細胞中C14ORF169蛋白表達顯著降低(t=475.0，P<0.05)，說明RKO細胞C14ORF169敲減穩定株構建成功；與對照組HCT116-NC細胞相比，HCT116-OE組C14ORF169蛋白表達顯著上調(t=286.3，P<0.05)，由此說明HCT116細胞C14ORF169過表達穩定株構建成功。

圖5 免疫印跡法檢測HCT116和RKO細胞系中C14ORF169蛋白表達

2.6 細胞藥物敏感性

CCK-8結果顯示，相較于RKO-NC組細胞，C14ORF169敲減后的RKO-KO組細胞對5-FU的敏感性明顯增加，48 h和72 h的IC50值分別為0.739 μg/mL和0.343 μg/mL；而C14ORF169過表達的HCT116-OE組細胞，在48 h和72 h的IC50值分別為3.581 μg/mL和1.909 μg/mL，相較于HCT116-NC組細胞，其對5-FU敏感性明顯降低(圖6)。結果表明，C14ORF169高表達可降低結直腸癌細胞對5-FU敏感性，反之則增強。

圖6 C14ORF169表達量不同的細胞系在不同時間點5-FU的IC50測定結果

3 討論

本研究基于GEPIA平臺分析TCGA數據庫中有關C14ORF169mRNA在多種腫瘤組織樣本及其相應正常組織中的表達水平，結果顯示，C14ORF169mRNA在結直腸腺癌、皮膚黑色素瘤、乳腺癌等多種腫瘤組織中表達較正常組織明顯上調。同時，利用Oncomine數據庫分析發現C14ORF169mRNA在結直腸腺瘤和結直腸癌組織中的表達水平均高于正常組織，說明C14ORF169作為一種腫瘤分子標志物，在腫瘤細胞中發揮著重要作用。進一步分析GEO數據庫中檢索的GSE12945數據集和GSE17536數據集發現，C14ORF169mRNA高表達結直腸癌患者總生存時間與疾病特異性生存時間明顯縮短(P<0.05)，并且C14ORF169mRNA高表達與結直腸癌AJCC分期明顯相關(P<0.05)，說明C14ORF169mRNA高表達往往導致腫瘤進展迅速、預后較差，C14ORF169是結直腸癌的預后危險因子，可能是結直腸癌中一種新的生物標志物。

淋巴管血管侵犯是結直腸癌明顯的預后不良因素[20]。小脈管受侵與淋巴結轉移有關，而且是獨立的預后不良因素，腸壁外大靜脈受侵也是獨立的預后不良因素，提示有肝轉移風險。若不進行治療，發生肝轉移的結直腸癌患者的中位生存期僅僅只有6～9個月[21]。已有淋巴管血管侵犯的結直腸癌患者往往已處于AJCC分期晚期。本研究結果顯示，C14ORF169高表達的結直腸癌患者多屬于AJCC晚期。而已有研究表明，C14ORF169高表達與結直腸癌轉移、淋巴管血管侵犯密切相關[16]。由此提示，C14ORF169可能通過促進結直腸腫瘤細胞侵襲、轉移等惡性生物學行為而引起患者預后不良。

5-FU常用于結直腸癌化療[22]，通常與奧沙利鉑、亞葉酸鈣聯合用于晚期或者轉移性結直腸癌的一線治療，降低AJCCⅢ期患者的腫瘤復發率[20]，有效延長患者生存期，改善生活質量。而化療耐藥患者往往療效不佳、預后差[23]，化療耐藥與結直腸癌患者的不良預后密切相關[24]。近年來，隨著對腫瘤分子生物學的不斷研究，對腫瘤中特定靶向分子的治療已成為抗腫瘤藥物的研發重心。本研究結果表明，在結腸癌細胞中敲減C14ORF169后，結腸癌細胞對5-FU敏感性增加，而高表達C14ORF169的結腸癌細胞則對5-FU表現出更強的耐藥性。由此提示，C14ORF169可能通過增強結直腸癌細胞的化療耐藥性而導致患者預后不良。

綜上所述，C14ORF169在結直腸癌中高表達，高表達C14ORF169的結直腸癌患者總體生存時間和疾病特異性生存時間明顯縮短，預后不良。這與C14ORF169高表達的結直腸癌患者多屬于AJCC晚期相關，也與C14ORF169高表達能增強結直腸癌細胞對5-FU的化療耐藥有關，但其具體作用機制還有待進一步研究和探討。